张金龙，任军，付玲，宋晓红，陈俭勤，吕鹏，侯利华

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071

神经生长因子（nerve growth factor，NGF）广泛存在于动物体内，以成年雄性小鼠颌下腺中含量最高，其次是豚鼠前列腺和蛇毒中。NGF是神经系统最重要的生物活性分子之一，对神经元细胞的生长、分化、修复和再生等均有很重要的作用[1-3]。NGF由α、β、γ亚基组成，具有生物学活性的为β亚基[4-6]。已有多家公司提取自小鼠颌下腺的鼠神经生长因子（mNGF）产品上市，对许多疾病如多发性硬化症、老年性痴呆及各种外周神经损伤等均具有潜在医疗价值[7-10]。分子排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）作为测定生物大分子纯度的方法，与SDS-PAGE等方法相比，具有操作简单、灵敏度高、重复性好等特点。我们拟建立测定mNGF纯度的SEC-HPLC法，并进行方法学验证。

1 材料与方法

1.1 材料

试验样品mNGF（批号20120602）为本实验室制备；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司。采用Waters公司的2695液相色谱系统、2487紫外检测仪，用Empower 2工作站软件采集并处理数据；色谱柱为TOSOH的TSK G3000 SWXL（7.8 mm×30 cm）。

1.2 方法

流动相为0.25 mol/L磷酸盐缓冲液（称取磷酸氢二钠54.65 g、磷酸二氢钠15.25 g、氯化钠8.5 g溶解于1 L水中，pH6.8），流动相流速为0.8 mL/min，进样体积20 μL，检测波长214 nm。采集后用Em⁃power 2对各谱图进行积分，分析计算相关数据。

对SEC-HPLC测定mNGF纯度的方法的专属性、线性、重复性、中间精密度、检测限、耐用性等进行验证，步骤如下。

1.2.1 专属性 取不含mNGF的空白溶剂（20 mmol/L 磷酸盐缓冲液，150 mmol/L NaCl），连续进样3次，然后取浓度为150 μg/mL的mNGF溶液，连续进样3次，观察空白溶剂在积分时间内是否存在吸收峰。判定标准：空白溶剂分析时在mNGF积分范围内无吸收峰出现。

1.2.2 线性 将mNGF分别稀释至50、100、150、250、400 μg/mL，每个稀释度溶液混匀后取3份样品上样，对目标峰面积进行线性评估。判定标准：相关系数大于0.98。

1.2.3 重复性 将mNGF稀释至100 μg/mL，连续进样6次。判定标准：峰面积RSD≤2.0%。

1.2.4 中间精密度 由分析员1对样品重复进样5次，3 d后由分析员2对相同样品再重复进样5次。判定标准：峰面积RSD≤2.0%。

1.2.5 检测限 将mNGF样品分别稀释至100、10、1 μg/mL后分别进样3次，计算峰面积及信噪比。判定标准：以峰面积的RSD低于20%且信噪比不低于10∶1的最低浓度作为定量限。

1.2.6 耐用性 分别以浓度为0.05、0.10、0.20、0.25、0.30 mol/L的磷酸盐缓冲液作为流动相，分别进样2次，观察保留时间及峰面积的变化。

2 结果

2.1 专属性

见图1，空白溶剂与mNGF溶液均在15.5～17 min出现典型的盐峰，经分析，是由于样品中磷酸盐含量与流动相不一致所致。mNGF主峰保留时间约为13.5 min，峰开始时间约为12.8 min，结束时间约为14.2 min，考虑到有可能有聚集体存在，确定积分范围为0～15 min。结果表明，在此范围内空白溶剂无峰出现。专属性符合要求。

2.2 线性

对图2各峰积分（见表1），而后以样品浓度为横坐标、峰面积平均值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 y=17521x-435768，相关系数 R2=0.9998（图 3）。结果表明，mNGF溶液浓度与吸收峰面积之间为线性回归，相关系数＞0.999，符合预定验收标准，表明在50～400 μg/mL浓度范围内，数据呈线性相关。

图1 专属性实验比较图

2.3 重复性 见图4，6次进样谱图基本一致。分析结果见表2，6次进样峰面积RSD为1.18%，小于2.0%。本方法重复性符合要求。

2.4 中间精密度 见图5，2名分析员分别于3 d内进样5次所得到的谱图基本一致，分析结果见表3，mNGF的RSD小于2.0%，本方法中间精密度符合要求。

表1 线性实验峰面积（μV·s）

图2 线性实验各浓度色谱峰比较图

图3 线性关系图

图4 重复性实验色谱比较图

2.5 检测限 见图6，1 μg/mL样品在主峰保留时间范围内无明显洗脱峰出现。积分并统计分析结果表明（表4），10 μg/mL样品3次进样峰面积RSD为12.441%，小于20%，且信噪比大于10∶1，符合标准，故将浓度为10 μg/mL、进样量20 μL即0.2 μg定为检测限。

表2 重复性实验保留时间、峰面积、纯度

表3 中间精密度实验峰面积（μV·s）

图5 中间精密度实验色谱比较图

2.6 耐用性 见图7，当磷酸盐浓度过低时，由于蛋白质与填料的非特异性吸附等原因，谱带展宽，回收率降低；但磷酸盐浓度在较小范围（0.2～0.3 mol/L）内波动时，保留时间RSD为0.07%，峰面积RSD为1.67%（结果未在表5中列出），即磷酸盐浓度小范围波动对mNGF的纯度检测影响很小。本方法耐用性符合要求。

3 讨论

图6 检测限实验各浓度比较图

图7 耐用性各条件比较图

表4 检测限实验保留时间、峰面积及信噪比

表5 耐用性实验保留时间及峰面积

我们采用的TSK G3000 SWXL分析柱，填料由刚性极好的孔径分布均匀的球形硅胶化学键合亲水化合物构成，颗粒大小为5 μm，专用于HPLC系统分离蛋白质与多肽，分离效率只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。以上验证结果表明，本方法分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化程度高，适用于mNGF纯度的检测，有着极好的应用前景。

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