曹梦洁，沈骥冬，程露露，王慧中，吴剑丙

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

石斛几种拮抗真菌的筛选鉴定

曹梦洁，沈骥冬，程露露，王慧中，吴剑丙

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

采用平板分离技术，从药用石斛根系中分离获得内生真菌，并通过平板对峙试验，筛选对石斛病原真菌有拮抗作用的菌株，进一步利用分子技术对其进行分类鉴定.结果表明：从石斛菌根中共分离获得2种拮抗真菌，分别属于黑孢属(Nigrospora)和葡萄座腔菌属(Botryosphaeria).

石斛；内生真菌；拮抗真菌

石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物，是我国十分重要的药用观赏植物，民间又称救命仙草、植物黄金，具有抗衰老、抗肿瘤、增强人体免疫力、抗血小板凝集及扩张血管等作用[1].石斛是一种典型的菌根共生体植物，自然条件下真菌与石斛根系形成一种特殊的菌根结构，在其生活史中发挥必不可少的作用.在自然条件下生长的石斛，其种子萌发、植株营养生长和生殖生长均需要与内生真菌共生，获得碳水化合物和其它营养物质[2-3].同时，研究者认为内生真菌作为石斛体内的有益优势菌群，能释放出拮抗物质，有效阻止其它病原菌侵入，增强寄主植物的抗病力[4].因此，筛选对植物病原真菌有拮抗作用的菌株，用于石斛人工栽培管理，能带来巨大的社会经济效益.

目前，病原真菌正严重威胁植物生产的安全和稳定，甚至造成毁灭性破坏.长期使用化学农药不仅增加农产品的生产成本，更造成严重的农药残留等环境污染问题.实践证明，把对病原真菌具有拮抗活性的植物内生真菌转接到植物体内进行生物防治，即将拮抗真菌开发成绿色微生物源农药，是当前控制病害发生和发展最为经济、有效和环保的手段，具有广阔应用的前景.本研究采用平板分离技术，从石斛根系中分离获得内生真菌，通过平板对峙试验，筛选对石斛病原菌有拮抗作用的菌株，进一步通过分子手段，鉴定拮抗真菌种类，为石斛人工栽培管理和绿色农药开发提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 供试材料

野生石斛和2种石斛病原菌为杭州师范大学生命与环境科学学院浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室采集保存.

1.2 内生真菌分离和纯化

取多年生老根及新鲜营养根根尖(4～5 cm)，经自来水冲洗干净后，用75%乙醇消毒60 s.弃乙醇，加入0.1%升汞，灭菌5 min后取出根尖，用无菌水冲洗3次.在无菌条件下用解剖刀将根尖横切成3～5 mm的薄片，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，切面朝向培养基.每个平板放置组织5块，25 ℃恒温避光培养3 d.

从培养基边缘挑取菌丝体转移至新鲜PDA平板，重复至获得纯培养物后，PDA斜面4 ℃保存.

1.3 拮抗真菌筛选

将分离得到的菌株与2种病原菌(赤霉菌Fusariumgraminearum和炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides)分别接种到PDA平板(5 cm)上，平板中心对称两点接种，距离约3 cm，以单独接种病原菌的平板作为对照，每组重复处理4次.在25 ℃、60%湿度环境下培养3 d后观察菌落生长情况，计算拮抗系数[5].拮抗系数分为5级：Ⅰ级，拮抗菌丝占据平板的100%；Ⅱ级拮抗菌丝占据平板>2/3；Ⅲ级拮抗菌丝占据平板<2/3，>1/3；Ⅳ级拮抗菌丝占据平板<1/3；Ⅴ级病原菌占据平板100%[6].

1.4 拮抗真菌分子鉴定

1.4.1 总DNA提取与电泳检测

从平板上刮取约0.1 g菌丝体于1.5 mL离心管中，，加入500 μL裂解缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA、400 mmol/L NaCl和2%SDS)，用电钻充分研磨后振荡，室温静置10 min，在4 ℃下12 000 rmp离心5 min.取上清液约300 μL，加入1 mL无水乙醇，在-20 ℃下静置20 min后， 4 ℃下12 000 rmp离心5 min.弃上清液，用75%的酒精洗沉淀1次，12 000 rmp离心5 min，弃上清并风干沉淀.用40 μL ddH2O溶解沉淀，-20 ℃保存备用.

取2 μL DNA样品在1%琼脂糖凝胶在电泳120 V，30 min，紫外灯下检测，凝胶成像系统拍照.

1.4.2 rDNA间隔区序列的PCR扩增

利用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增内生真菌rDNA ITS区段.

PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer(含Mg2+)2.5 μL、模板DNA2.0 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 1.5 μL、 ITS1(10 μmol/L) 0.6 μL、 ITS4(10 μmol/L) 0.6 μL 、Taq酶(2 U/μL) 0.4 μL、灭菌ddH2O19 μL.

扩增程序为：96 ℃预变性2 min;94 ℃变性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，35个反应循环,72 ℃延伸5 min.

1.4.3 ITS序列测定

PCR扩增产物用DNA片段快速纯化/回收试剂盒(鼎国生物有限公司)回收后，连接到PMD18-T 载体(TaKaRa生物有限公司)，转化感受态细胞EscherichiacoliDH-5α，选取阳性克隆进行序列测定(上海桑尼公司).

1.4.4 ITS序列数据分析

采用BlastN方法将获得的真菌ITS序列与GenBank中的DNA序列进行比对，认为实验所获得的真菌与序列同源性最高的真菌为同一属.

2 结果与分析

2.1 拮抗真菌菌株分离结果

从多年生老根及新鲜营养根根尖共分离得到内生真菌22株，编号为YN12-A，YN12-B，YN12-C，YN12-D，YN12-E，YN12-F，YN12-G，YN12-H，YN12-I，YN12-J，YN12-K，YN12-L，YN12-M，YN12-N，YN12-O，YN12-P，YN12-Q，YN12-R，YN12-S，YN12-T，YN12-U，YN12-V.将22种内生真菌分别与赤霉菌和炭疽菌进行平板对峙培养，结果表明，YN12-F和YN12-V与两种病原菌之间都有明显的抑菌区，它们产生的拮抗物质限制了病原菌的进一步生长，而对照组病原菌生长良好(图1).两种拮抗菌丝占据平板平面及拮抗系数均不同(表1).

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2.2 拮抗菌株基因的克隆和序列分析

菌株YN12-F测序获得大小为987 bp的基因片段，利用NCBI在线生物学软件BlastN对该序列进行同源性分析.结果显示，与黑孢属(Nigrospora)真菌稻黑孢菌(N.oryzae)的同源性最高，为99%.

菌株YN12-V测序获得大小为972 bp的基因片段，利用NCBI在线生物学软件BlastN对该序列进行同源性分析.结果显示，与葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌葡萄座腔菌(B.rhodina)同源性最高，为100%.

3 讨 论

石斛不仅是药用植物，而且作为一种观赏性植物迅速发展，形成一支重要的园艺产业.由于石斛野生资源遭到严重破坏，人工条件下进行大规模有效地繁殖已成为必然趋势.此外，每年由病原菌造成的损失达数千万元，而用化学方法对植物病原真菌进行防治会产生真菌抗药性，农产品生产成本的增加，土壤、水体和大气等环境的污染及农副产品农药残留等问题，筛选出有益的拮抗菌株将对提高人工栽培技术、植株的保护、提高经济效益等产生重要的作用.

本研究通过平板对峙实验和分子实验，鉴定到2种拮抗真菌，这2种拮抗菌YN12-F和YN12-V能抑制石斛病原真菌赤霉菌和炭疽菌的生长，其内生菌分别属于黑孢属[7]和葡萄座腔菌属[8]真菌.这2种属的真菌一般认为是植物病原真菌，但在本研究中发现它们属于石斛内生真菌，未引起石斛病害，并能抑制植物病原菌的生长.由于根据ITS序列分析，只能鉴定到属，因此，还需在后期通过分子、形态等手段对其进行进一步的鉴定.在此基础上，我们将通过控制变量法进一步探讨并优化拮抗真菌的培养条件，以达到对病原真菌的最佳抑制效果，为解决石斛生长问题提供一个现实途径，也为绿色微生物源农药的研制和植物菌肥的开发搭建平台.

[1] 陈晓梅,郭顺星.石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展[J].天然产物研究与开发,2001,13(1):70-75.

[2] Zhang Lichun, Chen Juan, Lv Yali,etal. Mycena sp., a mycorrhizal fungus of the orchid Dendrobium officinale [J]. Mycoogicall Progress,2012,11(2):395-401.

[3] Xing Yongmei, Chen Juan, Cui Jinlong,etal. Antimicrobial activity and biodiversity of endophytic fungi in Dendrobium devonianum and Dendrobium thyrsiflorum from Vietnam [J]. Current Microbiology,2011,62(4):1218-1224.

[4] 陈瑞蕊,林先贵,施亚琴.兰科菌根的研究进展[J].应用与环境生物学报,2003,9(1):97-101.

[5] 朱江敏,赵英梅,白坚,等.石斛共生真菌木霉菌拮抗作用的初步研究[J].杭州师范大学学报:自然科学版,2011,10(4):340-344.

[6] 宋漳，陈辉.绿色木霉对土传病原真菌的体外拮抗作用[J].福建林学院学报,2002,22(3):219-222.

[7] Zhang Lixing, Li Shasha, Tan Genjia,etal. First report of Nigrospora oryzae causing leaf spot of cotton in China [J]. Plant Disease,2012,96(9):1379-1380.

[8] Michailides T J, Morgan D P, Felts D. First report of Botryosphaeria rhodina causing shoot blight of Pistachio in California [J]. Plant Disease,2002,86(11):1273.

IsolationandIdentificationofAntagonisticFungifromDendrobiumPlants

CAO Mengjie, SHEN Jidong, CHENG Lulu, WANG Huizhong, WU Jianbing

(Colege of Life and Environment Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

The experiment isolated some endophytic fungi from the medicinal Dendrobium plants by plate separation technology, selected the strains with antagonistic activities to pathogenic fungi through plate confrontation test, and then identified the antagonistic fungi by molecular technology. The results show that there are two kinds of antagonistic fungi isolated from mycorrhiza, which belong to Genus Nigrospora and Botryospheria respectively.

Dendrobium; endophytic fungus; antagonistic fungus

2013-04-07

国家自然科学基金项目(30900954)；杭州师范大学科研启动经费项目(HSQK0080).

吴剑丙(1980—),女，副研究员，博士，主要从事微生物学研究.E-mail：jianbingwu@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.04.005

Q939.5

A

1674-232X(2013)04-0308-04