汪建明，赵 博，乔长晟

响应面法对出芽短梗霉黑色素提取工艺的研究

汪建明1,2，赵 博1，*乔长晟2,3

(1. 食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2. 天津北洋百川生物技术有限公司，天津 300457；3. 天津市工业微生物重点实验室，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

本研究以出芽短梗霉发酵液为原料提取黑色素，在单因素实验基础上选取实验因素与水平，用二水平实验确定影响黑色素色价的主要因素，然后根据Box-Behnken中心组合实验设计原理采用三因素三水平的响应面分析法，得到最佳提取工艺为：酸沉时间90 min、乙醇添加量93.17%、乙醇浓度90.42%。在此条件下提取黑色素色价可达44.8 μ/mL。

芽短梗霉；黑色素；响应面法；提取

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)又名出芽茁霉，分类属于半知菌纲，是一种具有酵母型和菌丝形态的多形真菌，广泛存在于植物茎、叶、果实表面及花粉、树蜜中，耐高渗透压[1]。可作为单细胞蛋白、细胞壁多糖、胞外多糖、果胶酶、色素等的生产菌株，其主要产物是短梗霉多糖，另外在多糖的分泌过程中也常常会伴随着黑色素的产生。黑色素() 是一类结构复杂多样的酚类或吲哚类生物大分子色素的总称[2]。通常与蛋白质、碳水化合物等络合形成不同类型的生物大分子物质，广泛分布于动物、植物和微生物中[3]。黑色素又可分为三类：真黑色素、棕黑色素、异黑素，不同种类来源的黑色素在结构上有着细微的差异[4]。Francesco De Angelis等人[5]从一种子囊菌的块菌中提取异黑素，并用气相色谱法对其进行了结构研究，根据气相色谱数据库搜索结果，认为该异黑素可能为多酚氧化物。由于该实验结果是在碱性还原条件下，在250 ℃测得的结果，而黑色素在这么高的温度下极易发生化学反应，因此该结构对于异黑素的结构只具有参考价值。Nicolaus等人[6]研究了鱿鱼黑色素的可能结构为吲哚环。由于天然黑色素不溶于水及有机溶剂，因此对其化学结构的研究很困难。目前给出的有关天然黑色素的结构还不完整，很多还只是一些基于研究结果的结构推测。

随着科学技术的发展，人们对合成食用色素的安全性产生很大质疑，合成色素的使用种类和数量也越来越受到限制。而天然色素以其安全可靠、色泽自然等优点受到广大消费者的欢迎。有些色素因兼有营养和药理作用，故在食品工业中得到越来越广泛的应用。响应面分析法是通过对响应面等值线的分析，寻求最优工艺参数，并用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间函数关系的一种统计方法。本研究基于对色素安全性和提取工艺的简便性考虑，基于响应面统计优化方法，采用酸沉醇沉提取工艺，旨在提高出芽短梗霉黑色素的品质和提取率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，北洋百川生物技术有限公司。

出芽短梗霉黑色素培养基：葡萄糖60 g/L，(NH4)2SO410 g/L，酪氨酸2.5 g/L，KH2PO40.25 g/L，牛肉膏15.08 g/L，ZnSO47 mg/L，MgSO4·7H2O 1.29 mg/L。

培养条件：装液量18 L，接种量5%（v/v），溶氧20%，初始搅拌转速400~500 r/min，与溶氧联动，通风比1.2 vvm，培养温度25℃，pH 6.0，培养时间3~5 d。

浓盐酸国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠天津市赢达稀贵化学试剂厂；无水乙醇国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水。

TDA-8002 水浴锅天津中环科技开发公司；UV-2401PC 紫外可见分光光度计日本岛津（SHIMADZU）公司；PHSJ-4A 数显pH计上海雷磁仪器厂；DH-204 电热恒温干燥箱天津市中环实验电炉有限公司制造；RE3000 旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；ZR-4000 超声波清洗器苏州富怡达超声波有限公司；SHZ-CB 循环水式多用真空泵上海羌强仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑色素紫外光谱扫描

1.2.1.1 黑色素吸收光谱的测定

将黑色素样品溶于NaOH溶液中，并以NaOH溶液作参比液，用紫外-可见分光光度计于190~600 nm处进行光谱扫描，测定黑色素的最大吸收峰值。

1.2.2 黑色素提取预实验

1.2.2.1 酸沉醇沉和碱溶酸沉法的比较

（1）酸沉醇沉：取100 mL发酵液，用HCl（5 mol/L）调pH至2.0，充分震荡，静置一段时间，在搅拌的条件加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50℃真空干燥至恒重。

（2）碱溶酸沉法：取发酵液100 mL，加入同等体积的NaOH（1 mol/L）溶液，充分震荡，50℃浸提6 h后3000 r/min离心10 min，收集所有上清，用HCl调pH至2~3左右，静置24 h，使其充分沉淀，然后在10000 r/min离心20 min，弃上清，得黑色素粗提物于80 ℃真空干燥至恒重[7]。

1.2.2.2 不同有机溶剂对醇沉效果的影响

取100 mL发酵液，用HCl（5mol/L）调pH至2.0，充分震荡，静置一段时间，在搅拌的条件加入体积分数分别为10%（v/v）、20%（v/v）、30%（v/v）、40%（v/v）、50%（v/v）、60%（v/v）、70%（v/v）、80%（v/v）、90%（v/v）、100%（v/v）、150%（v/v）、200%（v/v）的不同有机溶剂，观察实验现象。

1.2.3 出芽短梗霉黑色素提取单因素实验方法

1.2.3.1 不同发酵液浓缩比对黑色素得率的影响

分别取利用旋转蒸发仪，在150 r/min，60 ℃条件下，经浓缩比分别为0 %（v/v）、10%（v/v）、20%（v/v）、30%（v/v）、40%（v/v）、50%（v/v）的发酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）调pH至2.0，充分震荡，静置30 min，在搅拌的条件加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，测定黑色素的色价及得率一进行评价。

1.2.3.2 酸沉pH对黑色素得率的影响

取发酵液100 mL，用HCl(5 mol/L)调pH分别为1、2、3、4、5，充分震荡，静置30 min，在搅拌的条件加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，测定黑色素的色价及得率一进行评价。

1.2.3.3 酸沉时间对黑色素提取的影响

取发酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）调pH至2.0，充分震荡，分别静置时间0、30、60、90、120 min在搅拌的条件加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，测定黑色素的色价及得率一进行评价。

1.2.3.4 酸沉温度对黑色素得率的影响

取发酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）调pH至2~3左右，充分震荡，分别在0 ℃、20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃的恒温水浴中静置30 min，在搅拌的条件加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，测定黑色素的色价及得率一进行评价。

1.2.3.5 乙醇添加量对黑色素得率的影响

取发酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）调pH至2~3左右，充分震荡，静置30 min，在搅拌的条件向其中加入20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mL的无水乙醇醇沉使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，测定黑色素的色价及得率一进行评价。

1.2.3.6 不同乙醇浓度对黑色素得率的影响

取发酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）调pH至2~3左右，充分震荡，静置30 min，在搅拌的条件加入等体积浓度分别为20%（v/v）、40%（v/v）、60%（v/v）、80%（v/v）、100%（v/v）的乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，测定黑色素的色价及得率一进行评价。

1.2.4 最佳提取工艺的确定

以酸沉时间、乙醇添加量和乙醇浓度3个重要因素为自变量进行Box-behnken试验设计，各因素水平及编码值如表1。

利用软件Design expert8.0 软件分析各因素对出芽短梗霉黑色素提取得率的影响，找出最佳条件。

表1 响应面试验设计各因素及水平

1.2.5 色价的测定方法

发酵液的预处理：发酵液5000 r/min离心10 min除去菌体，提取方法为取100 mL发酵液，用5 mol/L HCl调pH至2~3左右，充分振荡，静置一段时间，在搅拌的条件加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50℃真空干燥至恒重。

黑色素的色价：参照国标GB6718-86，精确称取出芽短梗霉黑色素样品0.1 g(精确到0.002 g)，加入少量pH 10.0的氨水-氯化铵缓冲溶液使色素溶解，全部移入100 mL容量瓶中，加入缓冲溶液定容至刻度，振摇30 min，从中吸取10 mL色素液，移入另外一个100 mL容量瓶，用同样的缓冲溶液定容，摇匀，在540处测定其吸光值，色价计算公式如下[8-13]：

E1cm1%=A×r/W

式中：A为吸光值；W为样品的质量（g）; r为测定吸光值时所吸取样品的稀释倍数。

1.2.6 黑色素得率的计算

发酵液5000 r/min离心10 min除去菌体，提取方法为取100 mL发酵液，用5 mol/L HCl调pH至2.0，充分振荡，静置一段时间，在搅拌的条件加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重得黑色素粗提品M1[14]。出芽短梗霉黑色素得率计算公式如下：

得率（%）=M1/M×100

式中：M1：黑色素粗品的质量；M：黑色素发酵液的总质量。

1.2.7 统计分析

每个处理独立重复3次，文中数据为3次重复平均值+-标准差（S.D.）。显著水平< 0.05。

2 结果与分析

2.1 黑色素紫外光谱扫描

根据1.2.1中描述的方法，用紫外可见分光光度计在190~600 nm处对黑色素溶液进行光谱扫描，得到黑色素的吸收光谱，结果如图1所示。

图1 黑色素光谱图

由图1可以看出，黑色素在紫外光区有强烈的吸收峰且随着波长的增加吸光度逐渐降低，黑色素的特征吸收峰为200 nm。宁华等[15]从酪氨酸基因工程菌提取的黑色素紫外扫描显示无特征峰，段晓红等[16]人从嗜麦芽假单胞菌AT18所产黑色素的紫外吸收峰显示在210 nm处有一特征吸收峰，但是相同的一点是都能吸收所有波长下的光线，在紫外和可见光区域里吸收值都随波长的增大而逐渐降低。由合成黑色素的光吸收特性可知，黑色素具有光谱光吸收特征，是因为分子结构的高度共轭效应造成的。色素显黑色主要是其吸收多数可见光的结果。参考大量的文献[17-20]，选择540 nm的波长测定黑色素的吸收值。

2.2 黑色素提取预实验

2.2.1 酸沉醇沉和碱溶酸沉法的比较

利用文献中提到的碱溶酸沉的方法发酵液提取黑色素的产量达到了2.2 g/L。而利用酸沉醇沉的方法，固体物质析出之后溶液的颜色变为无色状态，表明黑色素完全析出且黑色素的得率为2.66%，样品易于收集，便于后续的稳定性研究和精制工作。

2.2.2 不同有机溶剂对醇沉效果的影响

根据1.2.2.2的实验方法，对出芽短梗霉黑色素进行提取。实验结果表明，黑色素在乙醇和甲醇溶液中均能沉淀析出，而在丙酮溶液中无法沉淀析出，考虑到乙醇溶液醇沉效果上清液为澄清透明的液体，而在甲醇溶液中上清液为浅黄色，综上所述，选取乙醇溶液为醇沉的最佳试剂。

2.3 黑色素提取工艺单因素确定

2.3.1 不同发酵液浓缩比对黑色素得率的影响

根据1.2.3.1的实验方法，对出芽短梗霉黑色素进行提取，实验结果如图2所示。

图2 发酵液浓缩比对黑色素提取的影响

由图2可知，随着浓缩比的逐渐增加其色价值逐渐增加，由于浓缩的比例逐渐增大，单位体积黑色素发酵液中色素的含量逐渐增大，其色价值明显高于不浓缩的发酵液的色价值。由于在使用分光光度法测色素吸光度过程中，浓度过大或过小的样品，误差很大。理论上推算，相对误差最小的部分在透度为36.8%处（或吸光度为0.4343处），故通常认为测定值在吸光度0.20~0.80范围内（透光度为20%~65%）误差较小，超出此范围，相对误差均会增大[21]。考虑到试验的方便可靠性，综上所述，选取原始发酵液来进行后续优化试验。

2.3.2 酸沉pH对黑色素得率的影响

根据1.2.3.2的实验方法，对出芽短梗霉黑色素进行提取，实验结果如图3所示。

图3 pH对黑色素提取的影响

由图3可知，随着pH逐渐升高获得黑色素得率及色价值先增高在pH 2后其色价和得率逐渐降低。因此，选取酸沉pH 2来进行后续优化试验。

2.3.3 酸沉时间对黑色素提取的影响

根据1.2.3.3的实验方法，对出芽短梗霉黑色素进行提取，实验结果如图4所示。

图4 时间对黑色素提取的影响

由图4可知，黑色素在静置30~60 min时，随着静置时间的增加黑色素的色价值逐渐增大，后随着静置时间的增加其色价值逐渐降低，在静置时间为60 min时其色价值最高因此。选取酸沉时间60 min来进行后续优化试验。

2.3.4 酸沉温度对黑色素得率的影响

根据1.2.3.4的实验方法，对出芽短梗霉黑色素进行提取，实验结果如图5所示。

图5 温度对黑色素提取的影响

由图5可知，随着温度的增加黑色素的色价值逐渐增大，温度80℃时其色价值最大，后随着温度的增加逐渐降低。因此，选取温度80℃为来进行后续优化试验。

2.3.5 乙醇添加量对黑色素得率的影响

根据1.2.3.5的实验方法，对出芽短梗霉黑色素进行提取，实验结果如图6所示。

图6 乙醇添加量对黑色素提取的影响

由图6可知，随着乙醇添加量的增加黑色素色价值逐渐增大，乙醇添加量为80%时其色价值最大，后随着乙醇的继续添加色价值逐渐降低。因此，选取乙醇添加量为80%来进行后续优化试验。

2.3.6 不同乙醇浓度对黑色素得率的影响

根据1.2.3.6的实验方法，对出芽短梗霉黑色素进行提取，实验结果如图7所示。

图7 乙醇浓度对黑色素提取的影响

由图7可知，随着乙醇浓度的增加黑色素的色价值逐渐增大，当乙醇浓度在60% 时色价值最大，乙醇浓度继续增加色价值逐渐减小。黑色素在乙醇浓度为40%时其黑色素得率最高为2.4% 色价值为22.6，乙醇浓度为60%时其色价值最高为38.6，但黑色素得率最低为1.21%。这可能是当乙醇体积分数较低时使大量水溶性杂质如多糖、蛋白质、淀粉等成分溶出，使得提取液变得粘稠，并对黑色素产生吸附作用，不利于黑色素的快速扩散溶出[22]。因此，选取乙醇浓度60%来进行后续优化试验。

2.4 重要影响因素的筛选

Plackett-Burman 设计法是一种2水平的试验设计方法，可以从众多的考察因素中，以最少实验次数估计出可信度大于95%的因素作为主效应。根据前期试验结果，实验选取的因素共有6个，每个因素取2个水平，按照文献中Plackett-Burman试验的方法设计各因素和水平，见表2所示。

表2 Plackett-Burman试验设计各因素与水平

2.4.1 响应值及方差分析结果

根据实验序号，取100 mL黑色素发酵液进行提取，得到的提取液在540 nm处测吸光值，结果如表3和表4所示。

表3 Plackett-Burman试验设计及响应值

表4 Plackett-Burman试验设计各因素水平及方差分析

二水平试验各因素的方差分析表如表7所示，从F值得大小可以看出，上面6因素按照显著性排列是B > C > D > F > E > A，且B、C、D这3个因素的F值的置信度均在90%以上，而E、A的置信度低于90%，选择3个主要因素作进一步的回应面分析，选择B、C、D这3个因素作响应面分析，以确定这些因素所对应的最优水平[24]。

2.5 黑色素提取工艺优化

2.5.1 最佳提取工艺的确定

以酸沉时间、乙醇添加量和乙醇浓度3个重要因素为自变量进行Box-behnken试验设计，各因素水平及编码值如表1，试验结果见表5。

利用软件Design expert8.0 对Box-Behnken试验结果进行回归拟合得到二价回归方程式为：

表5 响应面试验设计及结果

以X1、X2、X3分别表示酸沉时间、乙醇添加量、乙醇浓度，以Y表示响应值（色价）。实验数据经Design Expert 7.0软件进行二次回归分析，得到回归方程：

=50.96+0.831+1.682+0.653-0.5312-0.3313+0.2823-4.1712-3.8722-7.4232

2.5.2 回归方程各项的方差分析结果

通过进行方差分析来验证模型及各参数的显著度见表6。

表6 响应面方差分析

从方差分析可看出，模型Pr＞F小于0.05，表明该模型是显著的。同时模型中的参数X1、X2、X1X1、X2X2、X3X3都是显著的（Pr＞F小于0.05）。模型失拟项(Lack of Fit)表示模型预测值与实际值不拟合的概率[23]。表3中模型失拟项Pr＞F为0.6855＞0.05。因此，模型失拟项不显著，说明模型中不需要引入更高次数的项，模型选择合适；模型的相关系数R2为0.9904，大于0.9，模型拟合程度很好；同时，变异系数(CV)值为1.78，说明模型方程能够很好的反映真实的实验值。所以，可以用该模型来分析响应值的变化。经回归分析得出因素酸沉时间X1和乙醇添加量X2、酸沉时间X1和乙醇浓度X2、乙醇添加量X和乙醇浓度X对响应值色价交互作用影响显著。根据回归方程绘制响应面直观图。

图8 酸沉时间与乙醇添加量对色价影响的响应面图及等高线图

由图8可以看出，随着X1（酸沉时间）与X2（乙醇添加量）的增加，对响应值的影响都呈现先升高再降低的趋势。等高线图形比较圆，说明其交互作用不显著，从二者各自方向的变化疏密程度来看，也可以得出对响应值色价值的影响也不显著的结论。

图9 酸沉时间与乙醇浓度对色价影响的响应面图及等高线图

由图9所示，随着X1（酸沉时间）与X3（乙醇浓度）的增加，对色价值的影响都呈现先升高再降低的趋势；等高线因素X与X交互作用的等高线中，因素X1从实验编码从–1到0变化过程相对于编码0到1密集，说明X在编码–1到范围，响应值升高较快。

图10 乙醇添加量与乙醇浓度对色价影响的响应面图及等高线图

由图10可知，随着X2（乙醇添加量）与X3（乙醇浓度）的增加，对响应值的影响都呈现先升高再降低的趋势；其相应的等高图中，沿X2轴向等高线变化密集，而3轴向等高线的变化相对稀疏，故因素X2对响应值峰值的影响较X的影响大。同时因素X3从实验编码–1到0的过程中变化较编码0到1密集，说明在X3编码0到1范围，响应值升高较快。

整体模型回归方程也是极显著，相关系数R= 99.04%，说明响应值的变化有96.81%来源于所选变量，即酸沉时间、乙醇添加量和乙醇浓度。

经计算后可知，理论最佳酸沉醇沉提取工艺为:酸沉时间90 min、乙醇添加量93.17%、乙醇浓度90.42%。在此条件下，提取的黑色素色价理论值为44.88 μ/mL。

3 结论

本试验首先通过单因素实验确定发酵液浓缩比、酸沉pH、温度、时间、醇沉乙醇添加量、乙醇浓度在提取黑色素时色价的最高和最低值，然后通过二水平实验得出酸沉时间、乙醇添加量、乙醇浓度三个因素是对黑色素色价影响比较显著的因素，最后通过响应面实验得到响应面分析曲线，得到出芽短梗霉黑色素提取的最佳条件为：酸沉时间90 min、乙醇添加量93.17%、乙醇浓度90.42%。

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EXTRACTION TECHNOLOGY OF THE MELANIN FROMUSING RESPONSE SURFACE METHOD

WANG Jian-ming1,2, ZHAO Bo1,*QIAO Chang-sheng2,3

(1. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China; 2. Tianjin Peiyang Biotrans Biological Technology Company, Tianjin 300457, China; 3. Tianjin Key Laboratory of Industry Microbiology, Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The extraction of melanin fromfermented liquid was studied in this paper. On the basis of single factor experiments, the main factors that influence the valeur of melanin were determined by two-level experiment, and then the optimum conditions for the extraction of the melanin fromfermented liquid were obtained through a three-variable, three-level Box－Benhnken center－united experiment design and response surface methodology. The results showed that the optimum conditions were as follows: acid sinking time 90 min, ethanol add volume 93.17 % and ethanol concentration90.42 %. Under such conditions, the maximal valeur of melanin was up to 44.8 μ/mL.

; melanin; response surface methodology; extraction

TQ920.6

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.04.005

1674-8085(2013)04-0019-09

2013-04-01；

2013-05-09

天津市2011年科技支撑计划重点基金项目(11ZCKFNC01800);天津市东丽区2010年科委项目“传统调味品非热力抑菌技术的集成与示范”

汪建明(1972-)，女，新疆库尔勒人，教授，硕士，博士生导师(E-mail:Wangjianming@tust.edu.cn);

赵 博(1987-)，女，天津人，硕士生，主要从事食品加工技术和新产品研发(E-mail:404614141@qq.com).

*乔长晟(1969-)，男，吉林人，教授，硕士生导师，主要从事生物高分子及食品生物技术方向研究(E-mail: qiaochangsheng@tust.edu.cn);