黄颖颖 陈慎 杨成龙

摘 要：为进一步研究液态制种的培养条件对高色价红曲米的影响，提高液态种子液中红曲霉菌丝体数量和质量，更好地缩短发酵周期，促进高品质红曲米规模化大生产，对液态制种过程中的培养周期、培养温度、接种量、培养基起始pH值和装液量等主要培养条件进行优化。试验结果表明：红曲霉液态制种的最适培养条件为液态制种培养基的起始pH 5.5，接种量6%，培养温度35℃，培养周期24 h。经优化红曲霉的液态制种工艺，红曲米色价达6000～6200 u·g-1，发酵周期10～12 d，产品得率达35%～38%。

关键词：红曲霉;液态制种;红曲色素;色价

Abstract：In order to further research the effects of the culture conditions of liquid seed production on red yeast rice with high color value， improve the quantity and quality of monascus mycelium in liquid seed solution， shorten the fermentation period and promote the largescale production of highquality red yeast rice， the main culture conditions such as culture cycle， culture temperature， inoculum size， initial pH value of culture medium and loaded liquid were optimized. The results showed that the optimal culture conditions for liquid seed production of monascus were the initial pH of liquid seed production medium of 5.5， inoculum size of 6%， culture temperature at 35℃ and culture cycle of 24 h. After optimizing the liquid seed production process of monascus， the color value of red yeast rice was up to 6000-6200 u·g-1， the fermentation period was 10-12 d， and the production yield was up to 35%-38%.

Key words：Monascus; Liquid seed production; Monascus pigment; Color value

红曲色素是丝状真菌红曲霉的次级代谢产物，为食品添加剂中允许使用的唯一微生物来源的天然色素。近年来，由于红曲色素具有性质稳定、耐热性强，对蛋白质着色力好等优点，可取代亚硝酸盐（一级致癌物），在肉制品加工和水产品加工领域的使用量迅速增加，已跃升到红曲米和红曲色素最主要的应用领域，成为世界上生产量及使用量最大的天然食用色素之一[1]。由于红曲霉的生长速度相对缓慢，在红曲发酵生产的前期容易被杂菌污染，因此高色价红曲米的工业化生产一般采用纯种红曲二级种子制作的方法。传统的纯种红曲二级种子制作的方法是三角瓶固态菌种发酵法，培养红曲米作为红曲二级种子用于后续工业化生产。固态红曲米二级种子方便贮藏，但存在培养周期长、种子萌发缓慢、菌丝体生长不均匀等缺点。相比而言，液态二级种子悬浮液以其菌丝体粗壮、萌发点多且萌发面积大等优势已成为工厂化生产的发展方向[2]。采用液态制种取代传统的固态制种工艺，不仅能使红曲米发酵前期红曲霉萌发迅速成为优势菌，缩短发酵时间，而且能有效防止发酵前期易染杂菌的弊端，促进规模化大生产。

本课题组前期研发出一套纯种红曲液态制种工艺，但该工艺中存在菌丝体早衰、后期红曲米色价不高等问题。本试验采用本实验室保存的1株高色价红曲霉菌株，通过对前期液态制种的优化和红曲米产品色价的关系进行探讨，并通过二次旋转正交设计，探究液态制种工艺与红曲米产品色价的关系，以期得到高色价红曲产品的最优液态制种培养工艺。通过研究液态制种培养条件控制对红曲霉菌丝体生长持续性、产色能力、红曲米发酵周期及其产品品质的影响，优化液态制种工艺，将对福建省红曲产业的技术进步、提高福建省红曲行业的国内外市场竞争力具有积极意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 由本实验室特有的工业化生产价值的红曲霉菌专用种质资源库中筛选鉴定的代表性红曲霉菌株为研究对象。

1.1.2 仪器和试剂 恒温培养振荡器SKY200B（上海苏坤实业有限公司）;分光光度计721型（上海精密科学仪器有限公司）;无油真空泵HP01（天津市恒奥科技发展有限公司）;生化培养箱LRH150（上海一恒科技有限公司）;水浴锅（上海宝磊仪器有限公司）;电热恒温鼓风干燥箱DHG9070型（上海一恒科技有限公司）;手提式灭菌器DSX280A1（上海申安医疗器械厂）;洁净工作台SWCJIFD（苏州安泰空气技术有限公司）;电子天平AR2140[梅特勒托利多仪器（上海）有限公司]。

1.1.3 培养基 试管斜面培养基：麦芽汁10oBé、pH 6～7、琼脂2%，121℃灭菌30 min。

液態种子基本培养基：6%大米粉、2.5%蛋白胨、0.15% NaNO3、0.15% KH2PO4、0.1% MgSO4、pH 5.5。在250 mL三角瓶中装50 mL液态种子培养基并加入数颗小玻璃珠，121℃灭菌30 min。

固态发酵基本培养基：将糙米洗净后，与浸米水1∶1的比例浸泡6 h后沥干水分，121℃灭菌20 min后冷却备用。

1.2 红曲米培养工艺和色素的测定及计算方法

1.2.1 红曲米培养工艺流程

1.2.2 红曲霉试管斜面种子的制备 在无菌条件下，将红曲霉试管原菌接入试管斜面培养基中，置于35℃的恒温生化培养箱中培养13 d，备用。

1.2.3 红曲霉液态种子的制备 将菌种从斜面种子接到一级液态种子培养基后，置于35℃恒温摇床内，160 r·min-1振荡培养2 d后，按6%接种量接到二级液态种子培养基中，置于恒温摇床内培养1 d取出现用。

1.2.4 红曲米固态发酵培养 将二级液态种子接入固态发酵培养基中，于35℃恒温培养13 d，其间每12 h摇瓶1次，以防止培养基结块，培养48 h后每个三角瓶中分别补无菌水5 mL。培养结束后，取出红曲米于60℃通风干燥至含水量12%以下备用。试验各处理均为3次重复。

1.2.5 红曲米色价的测定及计算方法 参照国家标准《GB 1886.19-2015 食品添加剂红曲米（粉）》[3]进行检测。

1.2.6 菌丝体生物量测定 发酵液用纱布过滤，湿菌体用蒸馏水洗涤后，于60℃烘干至恒重后称重。

1.2.7 红曲米桔霉素的测定及计算方法 参照国标《GB/T 5009.222-2016 食品中桔青霉素的测定》[4]进行检测。

1.2.8 红曲米得率 固态发酵培养结束后，取出红曲米于60℃通风干燥至含水量12%以下，称质量，计算红曲米占初始糙米质量的比例为红曲米得率。

1.3 试验设计

1.3.1 液态制种的培养时间对液态种子液中菌丝体生物量和色价影响的研究 在pH 5.5，温度35℃培养，每隔6 h测生物量和色价，每个水平3次重复进行单因素试验，考察不同培养时间对红曲霉生物量和红曲米色价的影响。

1.3.2 液态制种的培养温度对液态种子液中菌丝体生物量和色价影响的研究 在pH 5.5，培养温度分别为26℃、29℃、32℃、35℃、38℃培养，每个水平3个重复进行单因素试验，考察不同培养温度制种对红曲霉生物量和红曲米色价的影响。

1.3.3 红曲霉液态制种培养条件的正交试验 以pH、转速、装液量三因素为研究对象，分别取3个水平，以505 nm处色价为参考指标进行三因素三水平试验，因素水平表见表1。

1.4 数据统计分析

采用Microsoft Office Excel 2007版办公软件进行统计处理试验数据，利用t检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 液态制种的培养时间对液态种子液中菌丝体生物量和色价的影响

从图2可知，红曲霉菌丝体次级代谢产生红曲色素，液态种子液中的菌丝体生物量和色价会随着液态种子培养时间的增加而增加，但到达一定程度后反而会有所下降，因此要控制好培养时间，选用液态种子液中菌丝体生物量达到最高且最粗壮旺盛的时间为培养周期，用于后续接种固态发酵培养。由图2可以看出，前24 h为菌体生长期，随后48 h是色素代谢期，再往后菌丝体生长和产色能力均减弱。菌丝体生物量均随着培养时间的增加而先增大后逐渐减少。当培养时间为2 d时，菌株的产色能力达到最大，色价逐渐趋于平缓。同时，用显微镜对菌株进行涂片观察菌丝和孢子的萌发状况，菌株的菌丝体粗壮，孢子萌发情况好（图3），与试验结果相符合。因此，选择液态种子培养24 h为后续试验的培养周期条件。

2.2 液态制种的培养温度对液态种子液中菌丝体生物量和色价的影响

从图4可知，温度的调节控制是影响有机体生长繁殖的最重要因素之一，因为任何生物化学的酶促反应都与温度变化有关。根据酶促反应的动力学来看，温度升高，反应速度加快，呼吸强度增加，最终导致细胞生长繁殖加快。但随着温度的上升，加快细胞的自溶速度，同时酶失活的速度也加大，影响生物的代谢产物。通过试验可知，在35℃附近效果最好。

2.3 红曲霉液态制种培养条件的正交优化

从正交试验结果的极差分析表2和方差分析表3可以看出，液态种子培养条件中影响红曲色素产量的主次因素为：pH>转速>装液量。在试验范围内，pH和转速对红曲霉产色素的影响均达显著水平，且pH的影响是极显著，这验证了其他学者的结论，而装液量的影响不显著，三者的最优组合为A3B2C1，即pH 5.5，转速180 r·min-1，装液量50 mL·瓶-1（250 mL）。优化后的培养条件是：pH 5.5，转速180 r·min-1，装液量50 mL·瓶-1（250 mL），培养时间1 d，培养温度35℃。在此条件下制备的液态种子液用于红曲米固态培养，红曲霉产色素的色价可达到6105.6 u·g-1。

3 结论与讨论

红曲霉作为我国重要的微生物资源和工业生产用菌，在食品工业中应用极广。红曲产品可分为酒曲、色曲和功能曲三类，除可发酵制成多种传统食品， 如红曲米、红曲黄酒、红腐乳等，还能合成广泛的具有生物活性的天然产物，如红曲色素，胆固醇抑制剂洛伐他汀及具有降血压、抗药、抗肿瘤、降糖生理活性的成分等[5]。與其他工业微生物相比，红曲菌具有有益产物多样性和高产性的特点，是国际范围内增长速度最快、产量和使用量最大的天然着色剂品种。药理研究表明，红曲色素具有广泛的生理活性，如抑制细胞癌变、抗菌活性、消除活性氧和抗突变等功效[6-7];又因其性质安全稳定、耐热性强，和对蛋白质着色力好等优点，近年来在食品工业上作为食品着色剂、食品原料广泛应用于肉制品加工和水产品加工领域，市场前景广阔。

我国是红曲的主要生产国，福建省又是我国红曲传统的发源地和主产区，其红曲产量和出口量均超过全国的一半以上，已出口到美国、法国、德国、日本和韩国等国家。福建红曲以品质优、色价高的特点，在国内外一直享有极高声誉[8]。欧亚各国以食品配料从中国进口红曲，用于火腿肠生产，其进口量已超过我国总产量的一半，因此具有广阔的应用前景[9]。本试验以红曲霉生物量和产色能力为考察指标，对液态制种培养条件进行优化。通过进行单因素和响应面优化试验，确定适宜的液态制种培养工艺。优化后的液态制种工艺为（一级种子和二级种子）：6%大米粉、2.5%蛋白胨、0.15% NaNO3、0.15% KH2PO4、0.1% MgSO4、pH 5.5，培养各24 h，培养温度35℃，转速180 r·min-1，装液量50 mL·瓶-1 （250 mL）。按6%接种量生产红曲米，红曲米色价达6000～6200 u·g-1，发酵周期10～12 d，产品得率达35%～38%。通过研究红曲霉液态制种工艺对红曲米产色素能力的影响，提高液态种子液中红曲霉菌丝体数量和质量，进而缩短发酵周期，实现高品质红曲米规模化大生产。

参考文献：

[1]PAN TM， HSU WH.MonascusFermented Products（2nd Ed.）[M].London：Food science，2014：815-825.

[2]杜士良.纯种红曲二级种子制作的两种方法[J].酿酒科技， 2001，104（2）：26.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 1886.19-2015食品添加剂红曲米（粉）[S].北京：中国标准出版社，2015.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB/T 5009.222-2016食品中桔青霉素的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.

[5]黄颖颖，陈慎，杨成龙，等.红曲色素和桔霉素代谢调控方法的研究进展[J].中国调味品， 2018，43（2）， 188-194.

[6]YANG C L，WU X P，CHEN B，et al.Comparative analysis of genetic polymorphisms among Monascus strains by ISSR and RAPD markers[J].Journal of the Science of Food & Agriculture，2016，97（2），636-640.

[7]黄颖颖，陆东和，杨成龙，等.微量营养源对红曲霉产洛伐他汀开闭环组分的影响[J].福建农业学报，2015，30（3）：286-292.

[8]杨成龙，杨晓君，邓思珊，等.几种维生素对红曲霉S产色素的影响[J].福建农业学报，2014，29（3）：266-270.

[9]杨成龙，陈章娥，吴小平，等.基因组ITS序列分析鉴定红曲霉菌株[J].核农学报，2015，29（2）：252-259.

（责任编辑：柯文辉）