傅兴圣，邹立思，刘训红，居文政，马 阳，侯 娅，李艳蓉

(南京中医药大学，江苏 南京 210046)

UPLC-ESI-TOFMS/MS分析太子参中环肽类成分

傅兴圣，邹立思，刘训红，居文政，马 阳，侯 娅，李艳蓉

(南京中医药大学，江苏 南京 210046)

建立超高效液相色谱-电喷雾飞行时间串联质谱(UPLC-ESI -TOF MS/MS)分析太子参中环肽类成分的方法。实验采用反相C18色谱柱，梯度洗脱，分离并检测太子参中11种环肽类成分。通过信息关联采集(IDA)模式，运用动态背景扣除 (DBS)，消除背景离子干扰，在获得11种环肽类成分MS/MS图谱的同时，也得到其精确的分子质量信息。

超高效液相色谱-电喷雾飞行时间串联质谱；太子参；环肽类

太子参是临床常用补益中药，为石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)PaxexPaxetHoffm.的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺之功效[1]。太子参含环肽类、苷类、糖类、挥发性物质、脂肪酸及酯类等化学成分，具保护心肌、促进免疫、抗氧化、抗应激、治疗糖尿病及止咳等药理作用[2-11]。目前已从太子参中分离得到16种太子参环肽类成分，其广泛的生理活性是医药领域研究的新热点。本实验采用超高效液相色谱-电喷雾飞行时间串联质谱(UPLC-ESI -TOF MS/MS)联用技术对太子参中环肽类成分进行精确质量数分析和鉴定，为探索太子参药材的功效物质基础、质量变化规律及质量调控机制提供技术支撑和参考。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

超高效液相色谱仪：日本Shimadzu公司产品；Triple TOF TM 5600 System-MS电喷雾飞行时间质谱仪：美国AB Sciex公司产品。

太子参环肽(Heterophyllin)A、B对照品：由云南昆明植物研究所谭宁华研究员提供；乙腈(色谱纯)：德国Merck公司产品；甲醇(色谱纯)：国药集团化学试剂有限公司产品；太子参对照药材(批号：121004-200604)：由中国药品生物制品检定研究院提供；水为自制超纯水；其他试剂为分析纯。

1.2供试品溶液的制备

取1.0 g太子参对照药材，加入50 mL甲醇，超声处理(功率250 W，频率30 kHz)45 min，冷却，过滤。滤液用旋转蒸发仪浓缩至干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

1.3实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：ODS C18(100×2.1 mm×1.8 μm)；流动相A：V(ACN)∶V(H2O)(含2 mmol NH4Ac及0.1%FA)=5∶95；流动相B：V(ACN)∶V(H2O)(含2 mmol NH4Ac及0.1%FA)=95∶5；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱条件：0～10 min、85%～50%A，10～20 min、50%～40%A，20～25 min、40%～85%A；柱温35 ℃；进样量10 μL；检测波长203 nm。

1.3.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)正离子模式，质量扫描范围m/z100～1 000，喷雾电压4.5 kV，气帘气(curtain gas)20 L/min，雾化气(Gas1)70 L/min，辅助气(Gas2)80 L/min，离子源温度400 ℃，碰撞电压30 V，碰撞室射出电压(CXP)9 V，碰撞气(CAD)6.9×104Pa，去簇电压(DP)100 V,射入电压10 V。

2 结果与讨论

2.1太子参中环肽类成分的UPLC-ESI-TOFMS/MS分析

根据设定的仪器条件，取供试品溶液进样分析。太子参甲醇提取液总离子流图示于图1。

图1 太子参甲醇提取液UPLC-ESI-TOF MS/MS总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of the methanol extract of Pseudostellariae Radix by UPLC-ESI-TOF MS/MS

根据文献报道的太子参环肽类成分，在总离子流图基础上对各环肽类成分提取离子流图，得到11种环肽的提取离子流图，示于图2。环肽对照品的串联质谱图示于图3。太子参中环肽类成分总离子流图的保留时间(tR)、质荷比(m/z)理论值和测定值列于表1，各成分的测定值和理论值相差较小。

太子参环肽在正离子模式下，灵敏度较高，主要出现[M+H]+峰，而其他碎片峰较小。图2中的峰1在MS中给出了m/z502.266 1 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z261.124 3、318.145 8、389.183 3，根据文献[8]推断其为太子参环肽Pseudostellarin A。

图2 11种环肽类成分的UPLC-ESI-TOF MS/MS提取离子流图Fig.2 Extract ion current chromatogram of 11 cyclic peptides in Pseudostellariae Radix by UPLC-ESI-TOF MS/MS

图3 太子参环肽对照品的串联质谱图Fig.3 MS/MS spectra of cyclic peptides references in Pseudostellariae Radix

表1 太子参中11种环肽类成分的UPLC-ESI-TOF MS/MS分析

峰2在MS中给出了m/z785.419 1 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z308.197 6、395.228 9、452.251 8、509.273 0、672.335 6，根据文献[10]推断其为太子参环肽Pseudostellarin F。

峰3在MS中给出了m/z683.351 3 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z302.151 2、399.204 6、513.248 0、570.269 7，根据文献[9]推断其为太子参环肽Pseudostellarin B。

峰4在MS中给出了m/z779.444 7 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z377.250 3、569.301 2，与文献[3]报道及Heterophyllin B对照品保留时间和质谱信息一致，确认其为太子参环肽Heterophyllin B。

峰5在MS中给出了m/z714.418 4 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z211.145 1、324.229 8、601.337 4，根据文献[10]推断其为太子参环肽Pseudostellarin D。

峰6在MS中给出了m/z813.451 0 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z358.213 9、471.298 9、629.368 3，根据文献[9]推断其为太子参环肽Pseudostellarin C。

峰7在MS中给出了m/z728.434 1 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z197.128 3、310.213 3、457.282 0、514.303 2、627.388 0，与文献[3]报道及Heterophyllin A对照品保留时间和质谱信息一致，确认其为太子参环肽Heterophyllin A。

峰8在MS中给出了m/z817.423 9 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z245.128 4、332.160 8、536.250 0、746、3 781，根据文献[11]推断其为太子参环肽Pseudostellarin G。

峰9在MS中给出了m/z861.450 5 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z294.182 7、663.352 2，根据文献[6]推断其为太子参环肽Pseudostellarin H。

峰10在MS中给出了m/z878.513 1 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z252.135 0、365.219 0、618.361 7、765.430 6，根据文献[10]推断其为太子参环肽Pseudostellarin E。

峰11在MS中给出了m/z665.366 03 [M+H]+，在MS/MS中给出了m/z330.182 6、387.204 1、534.272 1、647.358 1，根据文献[12]推断其为太子参环肽Heterophyllin D。

2.2讨论

目前，太子参品质评价的指标成分主要有皂苷、多糖、氨基酸、环肽等[13-20]，尤其是环肽类成分已作为太子参药材质量评价的法定指标[1]，但不同产区太子参中环肽含量差异显著，且与太子参传统药效的相关性尚不清楚。关于太子参中环肽类成分分析已有报道[18-19]，但只是用高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱分析太子参中环肽类化合物，对环肽类进行初步鉴定，难以确定其肽键的断裂顺序。本实验采用超高效液相色谱-电喷雾飞行时间串联质谱联用技术，通过信息关联采集模式，并运用动态背景扣除，消除背景离子干扰，对太子参中环肽类成分进行分析鉴定，提取离子流信号强度可进行环肽类成分的相对含量及定量分析；一级质谱给出了11种环肽类成分的精确质荷比，二级质谱给出了11种环肽类成分碎片离子的精确质荷比。

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AnalysisofCyclicPeptidesinPseudostellariaeRadixbyUPLC-ESI-TOFMS/MS

FU Xing-sheng，ZOU Li-si，LIU Xun-hong，JU Wen-zheng，MA Yang，HOU Ya，LI Yan-rong

(NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210046，China)

The cyclic peptides inPseudostellariaeRadixwere analyzed by ultra performance liquid chromatography-electro spray ionization time-of-flight-tandem mass spectrometry (UPLC-TOF MS/MS). Eleven cyclic peptides inPseudostellariaeRadixwere separated by a reversed-phase C18 column using gradient elute conditions. With the help of information dependent acquisition (IDA) mode and dynamic background subtraction (DBS), the interference of background ion was eliminated, and the MS/MS spectraogram of 11 cyclic peptides and accurate molecular mass were acquired.

UPLC-ESI-TOF MS/MS；PseudostellariaeRadix； cyclic peptides

O 657.63

A

1004-2997(2013)03-0179-06

10.7538/zpxb.2013.34.03.0179

2012-10-24；

2013-02-26

国家自然科学基金(No.81274016)；江苏高校优势学科建设工程项目(ysxk-2010)资助

傅兴圣 (1986～),男(汉族), 硕士研究生, 从事中药品质评价研究。E-mail：hlhfxs@163.com

刘训红 (1959～), 男(汉族),教授,从事中药鉴定与品质评价研究。E-mail：liuxunh1959@sohu.com