吴 杰

(中国矿业大学)

0 引言

Src是膜结合非受体酪氨酸蛋白激酶家族成员之一，在神经元的增殖、分化和存活中起着重要的生理作用［1-2］.Src在中枢神经系统均有表达，并且发现在大脑海马区高度表达［2，3］.大脑海马区是主要负责学习和记忆的脑区，海马神经元的损伤可导致脑缺血、老年痴呆等神经退行性疾病的发生［4-5］.研究表明，Src参与谷氨酸兴奋毒等神经病理过程，在海马神经元的损伤中发挥重要作用［6-8］.该研究拟构建Src的真核表达载体，为进一步研究Src的结构与功能以及其在神经退行性疾病的分子机制奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及细胞

大肠杆菌JM101、HEK293T细胞均为本实验室保存，真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司.

1.2 试剂

RNAgents Total RNA Isolation System、Acess RT-PCR System、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System、T4 DNA ligase、琼脂糖、NBT/BCIP显色系统购自Promega公司;限制性内切酶BamH I和EcoR I购自New England Biolabs公司;PuriLink Hipure Plasmid Midiprep Kit、1 Kb DNA ladder购自Invitrogene公司;鼠源抗Src抗体购自Upstate公司;兔源抗Actin抗体购自Cell Signaling公司;AP标记的鼠/兔二抗均购自Sigma公司.

1.3 引物设计及合成

根据Genebank中的大鼠Src基因编码序列(GI:4574718)，设计上下游引物，在上游引物的5’端引入BamH I酶切位点，下游引物的5’端引入EcoR I酶切位点(下划线)，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

上游引物:5’-CGGGATCCCGATGGGCAGCAACAAGAGC-3’

下游引物:5’-CGGAATTCCGCTATAGGTTCTCCCCGGGC-3’

1.4 目的基因的扩增

以SD雄性大鼠海马为材料，RNA提取试剂盒提取大鼠海马总RNA.以RNA为模板，用设计合成的Src的上下游引物经RT-PCR扩增出长约1600 bp的Src的全长DNA片段.

1.5 Src-pcDNA3.1真核表达载体的构建

将PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，然后将PCR产物和pcDNA3.1载体分别用限制性内切酶BamH I/EcoR I进行双酶切.琼脂糖凝胶回收酶切产物，将酶切产物(Src的……