黄志宏， 骆文志， 蔡兴东

(暨南大学附属第一医院呼吸内科，广东 广州 510632)

KLF16在肺腺癌中表达的临床意义及机制*

黄志宏， 骆文志， 蔡兴东△

(暨南大学附属第一医院呼吸内科，广东 广州 510632)

目的探讨Krüppel样转录因子16(Krüppel-like transcription factor 16，KLF16)蛋白表达在肺腺癌患者中的临床意义及机制，为探索肺腺癌患者预后生物标志物提供理论依据。方法收集我院50例肺腺癌患者的肿瘤组织标本，对其进行4～6年临床随访，免疫组织化学染色分析患者病理标本中KLF16蛋白的表达，探索KLF16蛋白表达与肺腺癌患者预后的关系及其意义。通过上调肺腺癌细胞中KLF16蛋白的表达，流式细胞术检测KLF16蛋白对肺腺癌细胞周期和凋亡的影响，证实KLF16蛋白在肺腺癌中表达的作用。结果50例肺腺癌患者中，KLF16蛋白低表达或不表达者29例，占58%(29/50)，在肺腺癌细胞中，KLF16表达明显低于其在正常支气管上皮细胞中的表达。KLF16蛋白低表达的肺腺癌患者，其5年生存率明显低于高表达KLF16的患者(P<0.01)，而且KLF16蛋白低表达是肺腺癌患者预后不良的重要预测指标。上调肺腺癌细胞中KLF16蛋白的表达可诱导肺腺癌细胞周期S期阻滞。结论KLF16在肺腺癌中是一个重要的抑癌蛋白，可作为肺腺癌患者重要的预测预后的分子标志物。

肺肿瘤; Krüppel样转录因子16; 肿瘤标志物

肺癌是当前全世界范围内导致癌性死亡的首要原因，而且其发病率仍处于上升趋势[1-2]。在常见的非小细胞肺癌的病理类型中，肺腺癌的发病率明显增加。目前肺癌的5年生存率在5%～14%之间，发展中国家5年生存率明显低于发达国家[3]。大多数肺癌患者在确诊时已处于中晚期，失去了手术根治的机会，并最终导致死亡。其主要原因是肺癌细胞的恶性增殖、侵袭和早期转移。肺癌的发病机制复杂，涉及遗传和环境因素等的复杂作用，具体机制仍不明确。

转录因子是一类具有重要转录调控功能的DNA结合蛋白，通过激活或抑制靶基因的转录来调控基因的时相性及特异性表达，因而在细胞生长、分化、凋亡等生理过程的调节中扮演重要的角色。Krüppel样转录因子(Krüppel-like transcription factors, KLFs) 是Sp1/Krüppel 样转录因子(Sp1-like and Krüppel-like transcription factors, Sp1/KLFs) 家族中的一个亚家族，通过与富含GC序列(包括GC盒和GT盒即CACCC盒)的多个基因的启动子区结合而发挥调节作用。目前在人类中发现17种KLFs，每一种KLF的N端含有独特的抑制或启动区，因而生理功能各异，并且各个KLF在组织中分布和mRNA翻译后调控也不相同[4]。KLFs可调控血细胞生成[5]、血管形成[6]、淋巴细胞生长[7]、肿瘤形成[8-9]和诱导性多能干细胞形成等[10]，因而在机体的各种病理和生理过程中发挥重要作用。

2002年Kaczynski等[11]鉴定了一个新的基础转录元件结合蛋白B4(basic transcription element-bin-ding protein 4，BTEB4)，BTEB4是一种新的广泛表达的Sp1样蛋白家族成员，后被命名为KLF16。研究显示，KLF16能够抑制胰腺癌细胞增殖，并通过Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因同系物基因(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)抑制胰腺癌细胞转化[12]。KLF16增加肿瘤细胞的凋亡率，并能通过调控细胞周期蛋白A 进而促使细胞周期停滞于S期，进而导致胰腺癌细胞增殖抑制。然而在人肺腺癌中，KLF16表达状况及其临床意义如何，尚无文献报道。因此，本文旨在分析KLF16在人肺腺癌中表达状况、与患者临床特征包括预后的关系，为探索KLF16能否作为肺腺癌预后判断的分子标志物提供科学依据。

材 料 和 方 法

1患者资料、病理标本收集和随访

收集暨南大学附属第一医院自2007年1月～2009年12月经病理确诊为肺腺癌患者50例，对其进行4～6年的随访。免疫组化分析患者确诊时石蜡包埋的病理切片，统计患者肺腺癌中KLF16蛋白表达与临床病理特征的关系。肺癌患者的病理分期及TNM分期参考第7版国际肺癌研究协会(International Association for the Study of Lung Cancer,IASLC)的分期标准[13]。肺腺癌患者的临床病理特征总结如表1。

表150例肺腺癌患者临床病理特征

Table 1. Clinicopathologic characteristics of 50 cases of patients with lung adenocarcinoma

Characteristicsn(%)Age(year) ≤6529(58.0) >6521(42.0)Gender Male30(60.0) Female20(40.0)Differentiation Poor20(40.0) Moderate22(44.0) Well8(16.0)Pathologicalstage ⅠA8(16.0) ⅠB14(28.0) IIA2(4.0) IIB4(8.0) IIIA6(12.0) IIIB8(16.0) Ⅳ8(16.0)Tclassification T112(24.0) T221(42.0) T37(14.0) T410(20.0)Nclassification N026(52.0) N110(20.0) N210(20.0) N34(8.0)Mclassification M040(80.0) M110(20.0)Smoking Yes28(56.0) No22(44.0)KLF16expression Negative5(10.0) Positive45(90.0) Lowexpression24(53.3) Highexpression21(46.7)Vitalstatus(asfollowup) Death29(58.0) Alive21(42.0)

2免疫组织化学染色和分析

采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(streptavidin-peroxidase conjugate，SP) 法进行免疫组织化学染色，分析肺腺癌患者石蜡包埋组织中KLF16蛋白的表达。兔抗人KLF16多克隆抗体购自Sigma，配制1∶200抗体工作浓度，具体步骤按SP及DAB显色试剂盒(中杉金桥)说明书进行。病理切片经染色后由2位病理科医师分析，KLF16在肺腺癌切片中的表达强度参考文献[14-15]评分如下：染色强度评分：0分(无染色)，1分(轻度染色：浅黄色)，2分(中度染色：黄棕色)，3分(重度染色：棕色)；染色阳性细胞数评分：0分(无染色阳性细胞)，1分(<10%阳性细胞)，2分(10～50%阳性细胞)，3分(>50%阳性细胞)。KLF16蛋白表达强度以染色指数=染色阳性细胞数×染色强度来评价，共记为0、1、2、3、4、6和9分。表达高低的最佳截断值基于log-rank检验分析肺腺癌患者病理组织中KLF16蛋白表达与患者预后关系来界定。其中染色指数≤4为低表达，>4为高表达。

3细胞培养、质粒转染及Westernblotting检测

人肺腺癌细胞A549、SPC-A1及正常对照细胞株16HBE均购自中国科学院上海细胞库。细胞株培养用含有10%胎牛血清(Gibco-BRL)、1×105U/L青霉素及100 mg/L链霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM,Gibco-BRL)完全培养基，并置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。包含重组人全长KLF16(NM_031918)cDNA的质粒pcDNA3.1(+)-KLF16及对照空质粒pcDNA3.1(+)均购自GeneCopoeia。A549及SPC-A1细胞分别通过Formentas 转染试剂进行转染，转染72 h后提取细胞总蛋白，Western blotting 检测转染后KLF16蛋白表达变化以证明是否上调了KLF16蛋白表达。肺腺癌细胞A549、SPC-A1及其分别转染空质粒pcDNA3.1(+)、过表达质粒pcDNA3.1(+)-KLF16后的总蛋白提取按KeyGene蛋白提取试剂盒提供说明书进行操作。SDS-PAGE(12%)分离蛋白后转印于PVDF膜上(Milipore)。以5%的脱脂牛奶封闭后，按目的(KLF16)和内参照(GAPDH)蛋白的分子量剪开PVDF膜，在4 ℃冰箱中分别孵育兔抗-KLF6抗体(1∶200, Sigma)和兔抗-GAPDH抗体(1∶2 500，北京博奥森)过夜，然后以含0.1% 吐温20的PBS(PBST)洗膜3～5次，每次5 min。继之用HRP交联的鼠抗兔II抗(1∶3 000，北京博奥森)室温孵育1 h，PBST洗膜3～5次后以ECL发光液(康为世纪)进行显色，待显色后压上胶片进行曝光显影，3～5 min后清洗胶片，晾干后成像保存并分析。

4流式细胞术检测

肺腺癌细胞株A549和SPC-A1分别转染pcDNA3.1(+)-KLF16和对照质粒pcDNA3.1(+)空质粒72 h，胰酶消化并收集所有细胞，1 000 r/min离心2 min，PBS重悬后离心弃上清，70%乙醇固定，4 ℃过夜。次日取上述细胞，1 000 r/min离心3 min，吸弃上清，加入PBS重悬，离心后弃PBS，每EP管留细胞约2×105个。加入100 mL RNase A，37 ℃水浴30 min。再加入400 μL PI 染色液混匀，4 ℃避光保存30 min。用流式细胞仪(FACSCalibur，BD)检测，记录激发波长为488 nm处得红色荧光，分析不同组间细胞周期分布的差异。

5统计学处理

以SPSS 16.0软件分析， Kaplan-Meier和 log-rank 检验分析KLF16蛋白不同表达组肺腺癌患者总体生存率的差异，Cox回归模型单因素和多因素分析肺腺癌患者不良预后的危险因素。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1KLF16在肺腺癌患者肿瘤组织及人肺腺癌细胞中的表达

免疫组化显示，在50例肺腺癌患者病理组织切片中，高表达KLF13蛋白的有21例，占42.0%(21/50)，而KLF13蛋白低表达或不表达者29例，占58%(29/50)。KLF16主要定位表达于肺腺癌细胞胞浆中，见图1A；Western blotting分析显示，KLF16蛋白(23 kD)在正常对照细胞16HBE中表达较高，而在肺腺癌细胞A549和SPC-A1中表达下调，见图1B。

Figure 1. Expression of KLF16 protein in human lung adenocarcinoma tissues (A, immunohistochemical staining, ×400) and lung adenocarcinoma cells (B, Western blotting). a: negative staining; b: moderate staining; c: strong staining. KLF16 protein was mainly located in the cytoplasm of tumor cells, and its expression in human lung adenocarcinoma cell lines A549 and SPC-A1 was lower than that in human bronchial epithelial cell line 16HBE.

图1KLF16在不同肺腺癌患者肿瘤组织和人肺腺癌细胞中的表达

2肺腺癌组织中KLF16低表达与肺腺癌患者不良预后相关

根据免疫组化分析KLF13蛋白表达与肺腺癌患者5年总体生存时间的关系，log-rank检验结果显示，KLF16蛋白高表达组与低表达组比较，肺腺癌患者5年生存率存在明显差异(P<0.01)。Kaplan-Meier 分析结果表明，KLF16高表达患者5年累计生存率为81%(95%CI: 0.695～0.923)，低表达KLF16患者 5年累计生存率为39.6(95%CI：0.371～0.651)，见图2。

Figure 2. The correlation between KLF16 protein expression in tumor tissues and the overall survival time of 50 cases of the patients with lung adenocarcinoma.The patients with none or low KLF16 expression in their tumor tissues had a poor prognosis.

图250例肺腺癌患者肿瘤组织中KLF16蛋白表达与患者总体生存时间的关系

3KLF16蛋白低表达是肺腺癌患者预后不良的重要预测因素

用单因素和多因素Cox回归分析来研究患者肿瘤组织中KLF16蛋白表达水平和其它临床指标，包括病理分期、肿瘤分化程度、肿瘤原发灶(tumor,T)、区域淋巴结(node,N)、远处转移(metastases,M)、肿瘤TNM分期等对患者预后的影响，进而分析KLF16蛋白表达在肺腺癌患者预后中的权重。如表2所示，单因素Cox回归分析结果显示，影响患者预后的有意义变量分别是KLF16蛋白表达水平、肿瘤分化程度、临床病理分期和肿瘤TNM分期(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示，KLF16蛋白表达水平和M分期是影响患者生存时间的独立预测因素。KLF16低表达患者的死亡风险比KLF16高表达患者增加了8.354倍(95% CI: 2.457～15.714)。而发生远处转移的肺腺癌患者，其死亡风险相对于未发生转移的肺腺癌患者增加了4.359倍(95% CI: 1.017～7.324)。上述结果表明，KLF16蛋白表达水平可能是影响肺腺癌患者预后的重要预测指标。

4上调肺腺癌细胞中KLF16蛋白表达可诱导细胞周期S期阻滞

为了证实KLF16在肺腺癌中的作用，我们通过质粒转染技术使肺腺癌细胞中过表达KLF16蛋白，进而用流式细胞术分析KLF16对肺腺癌细胞周期和凋亡的影响，结果表明，KLF16诱导细胞周期S期阻滞，见图3，而对细胞凋亡无明显影响(资料未显示)。这就证明，KLF16蛋白通过影响肺腺癌细胞周期，进而抑制细胞增殖，使得高表达KLF16的肺腺癌患者预后优于其低表达的患者。

讨 论

KLFs家族成员参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移的过程，是一种重要的肿瘤细胞调控因子[16-17]。KLFs蛋白与靶基因启动子区和/或相关调控蛋白相互结合，作为转录抑制或启动因子，或作为调控蛋白共激活和/或共抑制因子发挥作用[18-20]。此外，KLFs家族蛋白在不同的细胞类型、不同组织中表达不同，且功能各异[5,9]。因此，研究不同类型肿瘤组织中KLFs蛋白的具体功能，对于肿瘤个体化治疗及预后分析具有重要提示作用。

我们的研究结果显示，KLF16在肺腺癌中以低表达为多。低表达KLF16的患者，其5年累计生存率为39.6%，而高表达KLF16蛋白的肺腺癌患者，其5年累计生存率达81%，具有明显统计学意义。这就表明，在肺腺癌中，KLF16作为抑癌基因发挥作用。为了探讨KLF16蛋白表达在肺腺癌患者预后中的预测作用，Cox单因素与多因素回归分析KLF16蛋白表达、肿瘤分化程度、肿瘤TNM分期等对患者预后的预测作用，结果发现，KLF16蛋白表达高低和肿瘤患者是否发生远处转移是影响肺腺癌患者预后的重要因素。这提示在肺腺癌患者中，KLF16作为抑癌基因，其表达高低对患者预后具有特殊预测作用，具有重要临床参考价值。

Martin等[12]研究显示，在胰腺癌细胞中，KLF16抑制KRAS介导的肿瘤细胞生长与转化，诱导胰腺癌细胞凋亡及细胞周期S期阻滞。进一步研究发现，KLF16至少部分是通过结合在细胞周期蛋白A启动子区，抑制了细胞周期蛋白A的表达，进而诱导细胞周期S期阻滞。由于KLFs蛋白家族具有组织表达的特异性，我们在肺腺癌细胞中上调KLF16蛋白的表达并进行流式细胞术分析细胞周期的变化，结果显示，相对于转染空载体组，上调肺腺癌中KLF16蛋白表达后，其细胞周期S期明显增加，结果与Martin等研究一致。这就进一步证实了KLF16在肺腺癌患者预后预测中的临床价值。

表2Cox回归模型单因素和多因素分析肺腺癌患者不良预后的危险因素

Table 1. Univariate and multivariate Cox regression analyses of the risk factors of the poor prognosis in the patients with lung adenocarcinoma

UnivariateanalysisMultivariateanalysis VariablenSEP VariableHR(95%CI)PKLF16expressionKLF16expression Noneorlow290.560<0.01 Noneorlow8.354(2.457～15.714)<0.01 High21 High1.000Differentiation None/poor200.352<0.05NA Moderate/well30Pathologicalstage I～II280.401<0.05NA III～IV22Tstage T1～2330.328<0.05NA T3～417Nstage N0260.395<0.05NA N1～324MstageMstage M0400.421<0.01 M01.000<0.05 M110 M14.359(1.017～7.324)

NA: the data were not available.

Figure 3. Overexpression of KLF16 protein induced S-phase arrest in human lung adenocarcinoma cell lines A549 and SPC-A1. A: Western blotting analysis showed that the expression of KLF16 protein in A549 and SPC-A1 cells transfected with pcDNA3.1(+)-KLF16 plasmid was significantly higher than that in the cells transfected with empty vector, indicating that KLF16 protein was up-regulated in lung adenocarcinoma cells; B and C: flow cytometry plot of cell cycle analysis of A549 and SPC-A1 cells transfected with pcDNA3.1(+)-KLF16 plasmid or empty vector; D: cell cycle distribution of A549 and SPC-A1 cells after KLF16 protein was up-regulated. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1(+).

图3KLF16过表达诱导人肺腺癌细胞S期阻滞

总之，我们的研究结果提示，在肺腺癌患者中，KLF16蛋白以低表达为主，低表达KLF16蛋白的肺腺癌患者预后不良，5年死亡率明显增加。而且， KLF16蛋白低表达是肺腺癌患者预后不良的重要危险因素。因此，我们建议在对肺腺癌患者的肿瘤标本进行确诊分析时，可以引入KLF16蛋白的检测，从而能对肺腺癌患者的预后判断有重要的提示作用。

[1] Malvezzi M, Arfé A, Bertuccio P, et al. European cancer mortality predictions for the year 2011 [J]. Ann Oncol, 2011, 22 (4):947-956.

[2] Ahmedin J, Rebecca S, Jiaquan X, et al. Cancer Statistics, 2010 [J]. CA Cancer J Clin, 2010, 60 (5): 277-300.

[3] Lam WK, Watkins DN. Lung cancer: future directions [J]. Respiratory, 2007,12 (4): 471-477.

[4] Nuez B, Michalovich D, Bygrave A, et al. Defective haematopoiesis in fetal liver resulting from inactivation of the EKLF gene [J]. Nature, 1995, 375(6529): 316-318.

[5] Bieker JJ. Krüppel-like factors: three fingers in many pies [J]. J Biol Chem, 2001, 276(37): 34355-34358.

[6] Bhattacharya R, Senbanerjee S, Lin Z, et al. Inhibition of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis by the Kruppel-like factor KLF2 [J]. J Biol Chem, 2005, 280(32): 28848-28851.

[7] Outram SV, Gordon AR, Hager-Theodorides AL, et al. KLF13 influences multiple stages of both B and T cell development [J]. Cell Cycle, 2008, 7(13): 2047-2055.

[8] Liu J, Du T, Yuan Y, et al. KLF6 inhibits estrogen receptor-mediated cell growth in breast cancer via a c-Src-mediated pathway [J]. Mol Cell Biochem, 2009, 335(1-2): 29-35.

[9] Wang X, Zhao J. KLF8 transcription factor participates in oncogenic transformation [J]. Oncogene, 2007,26 (3): 456-461.

[10] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors [J]. Cell, 2006, 126 (4): 663-676.

[11] Kaczynski JA, Conley AA, Fernandez Zapico M, et al. Functional analysis of basic transcription element (BTE)-binding protein (BTEB) 3 and BTEB4, a novel Sp1-like protein, reveals a subfamily of transcriptional repressors for the BTE site of the cytochrome P4501A1 gene promoter [J]. Biochem J, 2002, 366(Pt 3): 873-882.

[12] Martin E, Fernandez Z, Gwen AL, et al. A functional family-wide screening of SP/KLF proteins identifies a subset of suppressors of KRAS-mediated cell growth [J]. Biochem J, 2011, 435(2): 529-537.

[13] Postmus PE, Brambilla E, Chansky K, et al. The IASLC lung cancer staging project: proposals for revision of the M descriptors in the forthcoming (seventh) edition of the TNM classification of lung cancer [J]. J Thorac Oncol,2007,2(8):686-693.

[14] Cai XD,Zhou YB,Huang LX, et al. Reduced expression of Krüppel-like factor 17 is related to tumor growth and poor prognosis in lung adenocarcinoma [J]. Biochem Biophys Res Commun. 2012,418(1):67-73.

[15] 卢均坤, 王艳芹, 孙云辉, 等. 非小细胞肺癌COX-2的表达与多药耐药性关系的研究[J].中国病理生理杂志, 2008, 24(3):605-606,616.

[16] Wang X, Lu1 H, Urvalek AM, et al. KLF8 promotes human breast cancer cell invasion and metastasis by transcriptional activation of MMP9 [J]. Oncogene, 2011, 30(16): 1901-1911.

[17] Yu F, Li J, Chen H, et al. Kruppel-like factor 4 (KLF4) is required for maintenance of breast cancer stem cells and for cell migration and invasion [J]. Oncogene, 2011, 30(18):2161-2172.

[18] Kaczynski J, Cook T, Urrutia R. Sp1-and Krüppel-like transcription factors [J]. Genome Biol, 2003, 4(2): 206.

[19] Lomberk G, Urrutia R. The family feud: turning off Sp1 by Sp1-like KLF proteins [J]. Biochem J, 2005, 392(Pt 1): 1-11.

[20] Roth C, Schuierer M, Gunther K, et al. Genomic structure and DNA binding properties of the human zinc finger transcriptional repressor AP-2rep (KLF12) [J]. Genomics, 2000, 63(3): 384-390.

ClinicalsignificanceofKLF16expressioninpatientswithlungadenocarcinoma

HUANG Zhi-hong, LUO Wen-zhi, CAI Xing-dong

(DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:cxd19790920@sina.com)

AIM: To investigate the clinical significance of Krüppel-like transcription factor 16 (KLF16) protein expression in the patients with lung adenocarcinoma for exploring the prognostic biomarkers for lung cancer.METHODSThe tumor tissue samples from 50 cases of lung adenocarcinoma were collected from our hospital, and 4～6 years of follow-up of the patients was obtained. The protein expression of KLF16 in the specimens was assayed by immunohistochemical staining. The correlation between KLF16 protein expression and prognosis of the patients with lung adenocarcinoma was also analyzed. The KLF16 protein was up-regulated in lung adenocarcinoma cells A549 and SPC-A1 by transfection with pcDNA3.1(+)-KLF16 plasmid, and the cell cycle and apoptosis of the A549 cells and SPC-A1 cells were determined by flow cytometry after transfection.RESULTSTwenty-nine cases of the lung adenocarcinoma patients showed low or no KLF16 protein expression in the total 50 cases (58%, 29/50). Furthermore, the KLF16 expression in the lung adenocarcinoma cells was significantly lower than that in normal bronchial epithelial cells. The 5-year survival rate of the lung adenocarcinoma patients with low expression of KLF16 protein was significantly lower than that of the patients with high expression of KLF16 protein (P<0.01), and low expression of KLF16 protein was an important predictor of poor prognosis for the patients with lung adenocarcinoma. Up-regulation of KLF16 protein expression in lung adenocarcinoma cells induced the cell cycle arrest in S phase.CONCLUSIONKLF16 is an important tumor suppressor in lung adenocarcinoma, and it can be used as an important molecular marker for predicting the prognosis of the patients with lung adenocarcinoma.

Lung neoplasms; Krüppel-like transcription factor 16; Tumor markers

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.011

1000- 4718(2013)11- 1978- 06

2013- 08- 21

2013- 10- 10

暨南大学培育基金资助项目(No. 21613312)

△通讯作者 Tel: 020-38688629; E-mail: cxd19790920@sina.com