刘 瑞， 郝春媛， 邓秀玲， 杨予白

(1西安交通大学医学院生理和病理生理学系，陕西 西安 710061； 2西安市第一医院心血管内科，陕西 西安 710002)

神经细胞黏附分子通过非Wnt依赖的β-catenin途径促进小鼠黑色素瘤细胞增殖

刘 瑞1△， 郝春媛2， 邓秀玲1， 杨予白1

(1西安交通大学医学院生理和病理生理学系，陕西 西安 710061；2西安市第一医院心血管内科，陕西 西安 710002)

目的研究神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)对小鼠黑色素瘤B16-F0细胞增殖的影响及其分子机制。方法采用RNA干扰在B16-F0细胞中基因沉默NCAM，通过MTT和软琼脂克隆形成实验考察细胞增殖能力的变化；通过小鼠皮下肿瘤移植实验考察体内黑色素瘤生长的变化；使用免疫印迹筛选出受NCAM影响的信号分子，在此基础上使用RNA干扰和高表达实验确定介导NCAM调控增殖的主要信号分子。结果NCAM基因沉默后B16-F0细胞的增殖能力和克隆形成能力明显降低，细胞在小鼠皮下形成的黑色素瘤的生长也明显受到抑制。其中，β-catenin介导了NCAM对于B16-F0细胞增殖的调控，但NCAM对于β-catenin的调控不依赖于经典的Wnt通路。结论NCAM通过Wnt非依赖性的β-catenin通路促进小鼠黑色素瘤细胞的增殖。

神经细胞黏附分子; 黑色素瘤; β-catenin; 细胞增殖

黑色素瘤是由神经脊来源的黑色素细胞异常增生引发的皮肤肿瘤，恶性程度极高，在皮肤肿瘤导致死亡的病例中，黑色素瘤占有约80%的比例，而且晚期黑色素瘤的预后很差，平均5年生存期不到5%[1]。黑色素瘤在我国发病近年来成倍增长，2000年发病率统计仅为 0.2/10万，2005-2007年我国发病率约1/10万，每年新发病例约2万人[2]，因此，黑色素瘤已经成为严重危及我国人民健康的疾病之一。晚期恶性黑色素瘤的临床治疗效果在近几十年来并没有明显的改善，作为恶性黑色素瘤化疗药物的金标准达卡巴嗪，其肿瘤治疗反应率也仅仅在5%左右[3]，因此对于黑色素瘤增殖和转移的机制研究，仍然是非常重要而迫切的任务，而对于调控黑色素瘤发生和发展的分子信号机制的评估对于找到新的治疗靶点具有非常重要的基础和临床意义。神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)为黏附分子中免疫球蛋白超家族的一员，按照分子量大小，共有NCAM120、NCAM140和NCAM180三种亚型。NCAM主要表达于神经系统，在神经细胞的增殖、分化、迁移以及轴突的生长中起着非常重要的作用，但近年来越来越多的研究发现，NCAM和多种肿瘤的发生发展有着密切的关系[4]。黏附分子和黑色素瘤的关系近年来引起了更多的关注，多种黏附分子可以通过介导细胞间黏附状态的变化以及信号转导参与黑色素瘤的发生和发展[5-7]，但是，关于NCAM和黑色素瘤的关系，目前除了少数临床描述性研究结果以外[8-9]，并无其它相关报道。为此，本研究拟采用小鼠黑色素瘤细胞系B16-F0为对象，考察NCAM与黑色素瘤细胞增殖的相关性以及其中介导的分子机制。

材 料 和 方 法

1材料

SPF级雌性C57BL/6J小鼠由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物的饲养和处死均遵循西安交通大学医学院伦理委员会制定的基本动物实验伦理原则进行。小鼠B16-F0黑色素瘤细胞购置于ATCC细胞库。细胞培养相关材料包括:细胞培养基高糖DMEM购自Gibco;胎牛血清(fetal calf serum, FCS)购自Invitrogen;NaHCO3购自Sigma;HEPES购自Sigma青、链霉素购自Invitrogen。RNA干扰质粒pSilencer 4.1-CMV购自Ambion。高表达β-catenin的质粒pβ-catenin为新加坡南洋理工大学生命科学院冯志伟教授馈赠。β-catenin的单链RNA干扰试剂β-catenin-siRNA (sc-29210)以及相应对照siRNA (sc-37007)购自Santa Cruz。Lipofectamine 2000和G418购自 Invitrogen。细胞增殖MTT试剂盒购自Roche Applied Science。实验中使用到的Ⅰ抗包括：NCAM(AB5032)购自Millipore；β-catenin (#9562)和p-LRP5/6 (Ser-1490；#2568)购自Cell Signaling Technology；LRP5/6 (sc-57354)购自Santa Cruz；β-actin(A5441)和GAPDH(G8795)购自Sigma。SYBR定量PCR试剂盒购自KAPA Biosystems。

2方法

2.1细胞培养 B16-F0细胞培养于高糖DMEM中，其中含有10% FCS、20 mmol/L NaHCO3、5 mmol/L HEPES以及 1% 青、链霉素，80%融合时传代。

2.2质粒构建和转染 选取针对NCAM的特异性靶序列5’-CGA CTT CTT TGG CCA CTA TAC-3’，把针对靶序列的能产生稳定小发夹RNA(small hairpin RNA, shRNA)的DNA序列克隆入RNA干扰质粒pSilencer 4.1-CMV中，以打乱后的随机序列构建的Scrambled shRNA为对照质粒。转染步骤严格按照Lipofectamine 2000的说明书进行操作。稳定表达NCAM shRNA(shNCAM)和scrambled shRNA(sh-CTRL)的细胞系用800 mg/L G418筛选。转染后6 h更换新鲜培养液，然后继续培养24 h后收集细胞用于下一步实验。

2.3细胞增殖实验 B16-F0细胞培养于96孔板中，接种密度为2 000 cells/well，培养时间96 h。细胞的相对增殖率使用具体方法为，收集各时点的细胞用含有MTT的新鲜培养液孵育4 h，然后在相应溶解液中孵育过夜后，在Tecan GENios测量仪上于570 nm下测量吸光度。实验均重复3次，取均值。

2.4软琼脂克隆实验 在60 mm培养皿中，2×104个肿瘤细胞培养在含0.3% 琼脂和10% FCS的高糖DMEM培养液中，其中培养皿预先用含0.35%琼脂的DMEM培养液包被。细胞克隆在14 d后用0.5%的结晶紫染色计数。实验重复3次取均值。

2.5皮下黑色素瘤动物模型 12只雌性C57BL/6J小鼠(6～8周，15～20 g)随机分为2组，每组6只，分别在背部皮下注射7.5×105个稳定表达shNCAM或shCTRL的B16-F0黑色素瘤细胞，间隔2 d观察皮下肿瘤的生长情况，3周后脱颈处死动物，分离皮下的肿瘤并测量肿瘤大小和重量。

2.6免疫印迹 细胞在裂解液(50 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA，5 mmol/L MgCl2，1% Triton X-100，1%甘油以及1×的蛋白酶抑制剂)中置于冰上裂解1 h，15 000×g、4 ℃离心15 min，收集上清蛋白液。蛋白液测量浓度后，取20～40 μg蛋白使用SDS-PAGE分离，然后把蛋白转移到PVDF膜上。其后使用5%的脱脂牛奶封闭1 h后，与含有第Ⅰ抗体的5%脱脂牛奶在4 ℃孵育过夜，PBST清洗后，再与HRP偶联的第Ⅱ抗体孵育1 h。此后加入反应发光液进行信号采集(Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物系统，购自Millipore)。实验均重复3次。

2.7实时荧光定量PCR 遵照KAPA SYBR定量PCR说明书进行，95 ℃预变性20 s，然后运行40个PCR循环，每个循环95 ℃ 3 s，60 ℃ 1 min。使用的引物序列为：Wnt3A 正义链5’-CTC CTC TCG GAT ACC TCT TAG TG-3’,反义链5’-GCA TGA TCT CCA CGT AGT TCC TG-3’；LRP5正义链5’-AAG GGT GCT GTG TAC TGG AC-3’,反义链5’-AGA AGA GAA CCT TAC GGG ACG-3；LRP6正义链5’-TTG TTG CTT TAT GCA AAC AGA CG-3’,反义链5’-GTT CGT TTA ATG GCT TCT TCG C-3’；Frizzled7 正义链5’-CGG GGC CTC AAG GAG AGA A-3’,反义链5’-GTC CCC TAA ACC GAG CCA G-3’;Frizzled8(正义链5’-ATG GAG TGG GGT TAC CTG TTG-3’,反义链5’-CAC CGT GAT CTC TTG GCA C-3’。

3统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较使用SPSS 17.0采用t检验以及方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1NCAM基因沉默显著抑制黑色素瘤细胞B16-F0的增殖

使用针对NCAM的能够产生shRNA的干扰质粒pSilencer 4.1-CMV-CAM转染细胞后，筛选出稳定表达shRNA的细胞系shNCAM，Western blotting显示该细胞NCAM的表达水平明显受到抑制,见图1A。MTT细胞增殖实验表明，在NCAM沉默后，细胞的生长速度明显下降(P<0.05),见图1B。同时，软琼脂克隆实验显示在NCAM沉默后，肿瘤细胞形成克隆的大小和数目均受到显著性抑制(P<0.05),见图1C、D。为了排除NCAM沉默后细胞总数目的降低可能由于凋亡增加引起，我们同时对比了两种细胞的凋亡比例，发现NCAM沉默对B16-F0细胞的凋亡并没有显著影响。这些结果提示，NCAM具有促进黑色素瘤细胞B16-F0增殖的作用。

Figure 1.NCAMsilencing inhibited the proliferation of B16-F0 cells. A: NCAM protein expression determined by Western blotting; B: cell proliferation detected by MTT assay; C: colony formation observed under microscope (crystal violet staining, scale bar=100 μm). Mean±SD.n=6 in B;n=9 in C.*P<0.05vsshCTRL.

图1NCAM基因沉默抑制B16-F0细胞的增殖

2NCAM基因沉默显著抑制B16-F0黑色素瘤在小鼠皮下的生长

分别在C57BL/6J小鼠皮下接种shCTRL野生型和shNCAM细胞，3周以后的结果表明，相比对照组，NCAM沉默的B16-F0细胞在皮下的生长受到显著抑制,见图2A，解剖分离出的肿瘤的大小和重量均存在显著差异，shNCAM细胞形成的肿瘤大小和重量均显著小于对照组(P<0.05),见图2B、C。以上的离体细胞培养和在体动物实验均表明，NCAM对于黑色素瘤细胞B16-F0的增殖具有显著促进作用，而下调NCAM的表达水平即可以明显抑制肿瘤细胞的增殖和生长。

Figure 2.NCAMsilencing inhibited the growth of melanoma in mice. B16-F0 cells were subcutaneously transplanted into the back of C57BL/6J mice. A: representative mice 3 weeks after transplantation, with arrows indicating the subcutaneous melanoma; B: the size of the tumors; C: the weight of the tumors. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsshCTRL.

图2NCAM基因沉默抑制小鼠黑色素瘤的生长

3NCAM通过β-catenin调控B16-F0细胞的增殖

NCAM沉默后，β-catenin水平明显降低,见图3A。β-catenin的下调能够明显抑制肿瘤细胞的增殖水平,见图3B；高表达β-catenin能够显著恢复shNCAM细胞的增殖性能,见图3C。以上实验结果说明，NCAM主要通过影响β-catenin而调控B16-F0细胞的增殖。

Figure 3. NCAM regulated the proliferation of B16-F0 cells via β-catenin. A: the expression of total β-catenin and cytosolic β-catenin in B16-F0 cells transfected withNCAMshRNA was detected by Western blotting; B: the proliferation of B16-F0 cells transiently transfected with β-catenin siRNA; C: the proliferation of B16-F0 cells withNCAMsilencing and/or β-catenin overexpression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsother groups.

图3NCAM通过β-catenin调控B16-F0细胞的增殖

4NCAM对β-catenin的调控不依赖于经典的Wnt信号转导途径

NCAM表达降低以后，磷酸化LRP5/6并无明显改变,见图4A。实时荧光定量 PCR结果表明受体Frizzled以及Wnt3A的表达水平均无显著变化,见图4B。上述结果说明，NCAM对于β-catenin的影响并非通过经典的Wnt/β-catenin途径，可能存在NCAM调控β-catenin的新的信号转导通路。

Figure 4.NCAMsilencing down-regulated β-catenin expression in B16-F0 cells via a novel pathway independent of canonical Wnt pathway. A: the phosphorylation of LRP5/6 was detected by Western blotting; B: the mRNA levels of Wnt3A and its receptors Frizzled7, Frizzled8, LRP5 and LRP6 were determined by real-time PCR. Mean±SD.n=4.

图4NCAM基因沉默并非通过经典的Wnt信号通路下调β-catenin表达

讨 论

NCAM是神经细胞表达的黏附分子，在调节神经细胞的黏附、增殖、分化、迁移和轴突的生长中起着重要作用。近年的研究发现，NCAM在多种肿瘤的发展中也起着重要作用，但NCAM和黑色素瘤的关系目前报道很少。本研究结果表明，NCAM能够显著促进小鼠黑色素瘤B16-F0细胞细胞的增殖，其中β-catenin为NCAM调控B16-F0增殖的主要信号分子，而NCAM对于β-catenin的调控独立于经典的Wnt/β-catenin信号转导通路。我们的研究成果阐明了NCAM激发的信号通路在黑色素瘤的进展中所扮演的角色，为黑色素瘤治疗方法的发展提供了更多的基础研究证据。

黑色素细胞在向黑色素瘤细胞转变的过程中，非常显著的行为学改变即是细胞增殖异常[10]，而且细胞的增殖能力也决定着黑色素瘤的进展和预后。关于黑色素瘤增殖调控机制的研究对于发展黑色素瘤新的治疗方法具有重要的意义。以往的研究已经揭示出NCAM参与了多种肿瘤的进展。我们的前期研究曾发现NCAM能够促进黑色素瘤细胞的侵袭和转移[11]，在本研究中，我们进一步揭示出NCAM能够促进黑色素瘤细胞的增殖，在黑色素瘤细胞B16-F0中沉默NCAM能够显著抑制黑色素瘤的生长，包括其增殖能力、克隆形成能力以及肿瘤的生长速度均得到抑制。近期的研究结果也发现，除了NCAM，其它免疫球蛋白超家族类的黏附分子，比如黏附分子CD171[12]和CD146[6]均能够促进黑色素瘤的进展。上述的结果揭示，黏附分子也许可以作为黑色素瘤进展的一个标志物。

NCAM不仅仅介导黏附，同时还可以激活多种信号通路，包括与黑色素瘤进展密切关联的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinosiol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路[13]。但是，在我们的研究中，并没有发现这两条经典信号通路参与了NCAM促进肿瘤细胞增殖的信号转导。我们的实验表明，β-catenin为NCAM调控B16-F0细胞增殖的中心分子。以往的研究曾经报道过β-catenin信号通路可以促进或者抑制黑色素瘤的进展，比如Chien等[14]发现Wnt3分子能够通过提高β-catenin水平而抑制B16-F0细胞的增殖，这个结论似乎和我们的研究结果存在矛盾。不过在他们的实验中，使用RNA干扰降低β-catenin的水平却不能够改善Wnt3分子对于黑色素瘤细胞增殖的抑制效应，显然Wnt分子和β-catenin对于黑色素瘤增殖的影响并不一致。而在本研究中，我们是同时进行β-catenin的上调和下调来观察其对于黑色素瘤细胞增殖的影响，能够更有力地说明NCAM是通过β-catenin促进黑色素瘤细胞的增殖。

β-catenin是经典Wnt通路的中心分子，在缺乏Wnt分子的刺激下，β-catenin在蛋白复合体中被糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)持续磷酸化而不具有信号转导作用[15]。当Wnt分子结合到受体Frizzled和LRP5/6后，抑制β-catenin的GSK-3β即脱离蛋白复合体，释放出的游离β-catenin即可以进入细胞核而激活相应的基因表达。在经典的Wnt/β-catenin通路中，β-catenin的上调总是伴随着Wnt分子和其受体的表达增加以及受体LRP5/6的磷酸化。但是，在NCAM激活β-catenin的信号转导中，我们的实验结果并没有发现同时并存的表达上调的Wnt分子和其受体Frizzled，也没有发现LRP5/6磷酸化水平的升高。显然，NCAM对于β-catenin的调控不依赖于经典的Wnt/β-catenin通路，在NCAM到β-catenin的信号转导上，应该存在着一条新的转导通路，使NCAM可以通过调控β-catenin的水平控制黑色素瘤细胞的增殖。

总之，我们的研究结果发现了NCAM通过调控β-catenin而促进黑色素瘤细胞的增殖，而NCAM对于β-catenin信号的影响独立于经典的Wnt通路。我们的研究揭示了NCAM在黑色素瘤增殖中所起的作用，同时丰富了β-catenin为基础的信号通路系统。鉴于NCAM的抗体已经用于NCAM高表达肿瘤的临床试验中[16-17]，而且拮抗NCAM的多肽也正处在积极的开发阶段[18]，我们的成果为研究黑色素瘤新的治疗方法提供了一个值得参考的靶点。

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NeuralcelladhesionmoleculepromotesproliferationofmousemelanomaB16-F0cellsviaβ-cateninindependentofcanonicalWntpathway

LIU Rui1, HAO Chun-yuan2, DENG Xiu-ling1, YANG Yu-bai1

(1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,MedicalSchool,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofCardiology,Xi’anNo. 1Hospital,Xi’an710002,China.E-mail:dr.liurui@gmail.com)

AIM: To investigate the effects of neural cell adhesion molecule (NCAM) on the proliferation of mouse melanoma B16-F0 cells, and to further explore the involved signaling pathways.METHODSRNA interference was used to silence the expression ofNCAMin B16-F0 cells, followd by MTT and soft agar assays to evaluate the proliferation. Subcutaneous transplatation ofNCAM-silencing B16-F0 cells into C57BL/6J mice was performed, and the tumor growthinvivowas observed. Western blotting was used to clarify the involved signaling pathways.RESULTSThe proliferation and colony formation of B16-F0 cellsinvitroand the growth of transplanted melanomainvivowere significantly inhibited byNCAMsiRNA. Interestingly, the change of NCAM expression level markedly regulated the activity of β-catenin, and this signaling pathway was independent of canonical Wnt pathway.CONCLUSIONOur findings reveal a novel regulatory role of NCAM in the progression of melanoma, which might serve as a new therapeutic target for the treatment of melanoma.

Neural cell adhesion molecules; Melanoma; β-catenin; Cell proliferation

R739.5

A

1000- 4718(2013)09- 1645- 06

2013- 05- 14

2013- 07- 09

△通迅作者Tel： 029-82655164; E-mail： dr.liurui@gmail.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.019