蔡松旺, 谢迭来, 翁毅敏, 温星桥, 张军航

(中山大学附属第三医院， 1胸外科， 2放射科， 3泌尿外科， 广东 广州 510630)

p21活化激酶6对人非小细胞肺癌A549细胞侵袭及迁移能力的影响*

蔡松旺1△, 谢迭来2, 翁毅敏1, 温星桥3, 张军航1

(中山大学附属第三医院，1胸外科，2放射科，3泌尿外科， 广东 广州 510630)

目的探讨p21活化激酶6(PAK6)对非小细胞肺癌侵袭及迁移能力的影响及机制研究。方法实时荧光定量PCR检测人非小细胞肺癌A548细胞、人支气管上皮细胞、非小细胞肺癌组织及癌旁组织中PAK6 mRNA的表达。A549细胞分别转染siRNA-PAK6(siPAK6组)和阴性对照(对照组)，实时荧光定量PCR技术检测PAK6 mRNA，Western blotting检测PAK6表达量；并行体外迁移及侵袭实验，检测转染siRNA-PAK6对A549细胞侵袭及迁移能力的影响；共聚焦显微镜观察细胞骨架的改变。结果A549细胞中PAK6 mRNA的表达量明显高于人支气管上皮细胞中PAK6 mRNA的表达量(3.50±1.16vs1.12±0.42，P<0.05)，非小细胞肺癌组织中PAK6 mRNA的表达量明显高于癌旁组织中PAK6 mRNA的表达量(5.13±1.33vs1.08±0.37，P<0.05)。A549细胞转染siPAK6后，PAK6蛋白表达量下降72%(P<0.05)，PAK6 mRNA水平明显下降(3.72±0.75vs0.69±0.21，P<0.05)。A549细胞转染siPAK6组侵袭及迁移出的细胞数量明显少于对照组(P<0.05)。siPAK6组A549细胞骨架应力纤维减少明显，肌动蛋白皱缩。结论PAK6通过细胞骨架的重构影响非小细胞肺癌的侵袭及迁移能力。

p21活化激酶6； 非小细胞肺癌； 肿瘤侵袭； 细胞迁移； 细胞骨架

p21活化激酶-6(p21-activated kinase 6，PAK6)是以雄激素受体的配体结合上的氨基酸序列629-919, 通过酵母双杂交识别出来的新的雄激素受体关联蛋白，主要表达于前列腺、睾丸和大脑等器官[1]。我们在前期研究中发现PAK6可以减弱前列腺癌侵袭、迁移能力[2-3]，目前关于PAK6在肺癌细胞中的作用报道较少，因此，本文拟通过RNA干扰技术，研究PAK6在肺癌A549细胞侵袭及迁移中的作用。

材 料 和 方 法

1主要试剂

人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE细胞)和非小细胞肺癌A549细胞购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所；细胞培养液RPMI-1640和胎牛血清(Gibco)，转染试剂Siport(Ambion)，Trizol试剂(Invitrogen)，siRNA(Santa Cruz Biotechnology)，兔抗人PAK6多克隆抗体(Merck)，Ⅱ抗(Cell Signal Technology)，Transwell小室(Corning，24孔，孔径8 μm)，基质胶(BD)，FITC-phalloidin( Sigma)。

2主要方法

2.1细胞培养与转染 HBE及A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液于37 ℃、5% CO2的湿化环境中培养。转染前将细胞接种于6孔板中，待细胞汇合80%左右时，按照siPORT脂质体转染法说明书操作，进行siRNA-PAK6 (siPAK6)或阴性对照转染细胞。

2.2实时荧光定量PCR技术检测PAK6 mRNA的表达 使用Invitrogen公司的Trizol试剂，按照一步法进行总RNA提取。 以PrimerScriptTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒逆转录成单链cDNA，GoTaq® Green Master Mix扩增。PAK6上游引物5’- GACTCCATCCTGCTGACCCTC-3’，下游引物5’-CACCTCAGTGGCATACAAAGACC-3’； 扩增片段长159 bp。内参照β-actin A0001引物序列TGACGTGGACATCCGCAAAG，β-actin A0002引物序列CTGGAAGGTGGACAGCGAGG。实时荧光定量PCR反应(用ΔCt法定量)：阴性质控标准品采用灭菌双蒸水，待测样本按50 μL反应体系进行，反应条件为：93 ℃ 3 min预变性，然后93 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s进行40个循环。

2.3Western blotting检测 转染48 h后，将6孔板

培养细胞消化离心后，加入蛋白裂解液冰上裂解5 min，冷冻离心提取蛋白，经BCA法检测蛋白浓度。将蛋白样品25 μg加样后SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，Ⅰ抗(1∶1 000)、Ⅱ抗(1∶2 000)孵育，发光检测，GAPDH作为内参照。Quantity One软件定量分析。

2.4CCK-8法检测细胞活性 按照试剂盒说明书处理细胞，每组设4个复孔，450 nm作为检测波长。细胞活性=(处理组A值-空白孔A值)/(对照组A值-空白孔A值)。

2.5体外侵袭及迁移实验 细胞在无血清RPMI-1640培养液培养24 h后，消化细胞，每个Transwell小室铺1∶8 基质胶80 μL，接种5×104个细胞，加含0.2% BSA无血清RPMI-1640培养液至200 μL，下室加500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，孵育24 h后棉签擦去上室未穿过的细胞，4%甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染色。按顺序拍照16个视野并计数取平均值。迁移实验不需铺胶，孵育时间为16 h。

2.6共聚焦显微镜观察细胞骨架 A549细胞接种于6孔板中，转染48 h后，预温PBS液清洗细胞2次，4%甲醛室温固定10 min，PBS液清洗3次。含1% BSA的PBS液室温封闭1 h，FITC-phalloidin(5 mg/L)室温避光染色1 h，PBS液清洗3次。

3统计学处理

数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，应用SPSS统计软件13.0分析，采用Student’st检验进行组间均数比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1PAK6mRNA在A549细胞、HBE细胞、非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达

A549细胞中PAK6 mRNA的表达量明显高于HBE细胞中PAK6 mRNA的表达量(3.50±1.16vs1.12±0.42，P<0.05)，差异有统计学意义，见图1A；非小细胞肺癌组织中PAK6 mRNA的表达量明显高于癌旁组织中PAK6 mRNA的表达量(5.13±1.33vs1.08±0.37，P<0.05)，差异有统计学意义，见图1B。

2CCK-8法检测转染siPAK6后A549细胞活性

A549细胞转染siPAK6后，24 h细胞活性为(97.39±12.72)%，48 h细胞活性为(102.04±12.21)%，72 h细胞活性为(99.90±8.49)%，见图2。

Figure 1. Expression of PAK6 mRNA in A549 cells, HBE cells(A)，non-small-cell lung cancer tissues and adjacent non-tumor tissues (B).Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsHBE;#P<0.05vsadjacent non-tumor tissues.

图1PAK6在A549细胞、HBE细胞中的表达

Figure 2. Viability of A549 cells after siPAK6 transfection.Mean±SEM.n=5.

图2转染siPAK6对A549细胞活性的影响

3转染siPAK6后A549细胞中PAK6变化

A549细胞转染siPAK6 48 h后，PAK6 mRNA水平下降 (3.72±0.75vs0.69±0.21)，PAK6蛋白表达量下降72%,差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

Figure 3. Knockdown ofPAK6 by siRNA for 48 h efficiently repressed either mRNA (A) or protein (B) levels of endogenous PAK6 in A549 cells.Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsNC.

图3转染siPAK6对A549细胞PAK6mRNA及蛋白水平的影响

4siPAK6对A549细胞侵袭及迁移能力的影响

用30 nmol/L siPAK6转染48 h后，转染siPAK6组A549细胞侵袭及迁移出的细胞数量明显少于对照组(P<0.05)，说明转染siPAK6后，A549细胞侵袭及迁移能力下降，见图4。

Figure 4. Knockdown ofPAK6 by siRNA decreased A549 cell migration (A) and invasion (B)invitro(crystal violet staining,×40).Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsNC.

图4转染siPAK6对A549细胞侵袭及迁移能力的影响

5siPAK6对A549细胞骨架的影响

siPAK6组A549细胞骨架应力纤维明显减少，肌动蛋白皱缩，表明转染siPAK6后A549细胞骨架发生重构；在×10视野下，放大倍率、实验数据采集像素点、光切聚焦平面和厚度、激发和检测波长、检测电压等参数均一致情况下，连续拍摄10个视野，siPAK6组荧光强度(86.75±5.81)明显弱于对照组(152.78±9.09)，差异有统计学意义(P<0.01)，见图5。

Figure 5. Knockdown ofPAK6 by siRNA impaired cytoskeleton of A549 cells. Stress fibers (polymerised actin) and actin filaments were demonstrated by FITC-phalloidin staining.

图5转染siPAK6对A549细胞骨架的影响

讨 论

鉴于PAK6在恶性肿瘤中的作用，我们检测了非小细胞肺癌A549细胞中PAK6的表达量，结果表明PAK6在A549细胞中表达量显著高于正常支气管上皮细胞。我们进一步检测了非小细胞肺癌组织及正常肺组织PAK6表达量，结果显示PAK6在非小细胞肺癌组织中表达量显著高于正常肺组织。以上结果表明PAK6与非小细胞肺癌相关，但目前尚未见到相关报道。

远处迁移是癌症患者最主要的死亡原因[4]，为了进一步了解PAK6在非小细胞肺癌中的作用，我们通过转染siPAK6观察对A549细胞侵袭及迁移能力的影响。结果表明下调PAK6表达后A549细胞侵袭及迁移能力明显减弱。进一步表明PAK6在非小细胞肺癌迁移机制中起重要作用。

细胞骨架是一种存在于细胞浆中的纤维网架结构体系，具有维持细胞形态及细胞运动的功能，在细胞迁移及侵袭功能中起重要作用[5-6]。我们通过共聚焦显微镜观察，可明显看到转染siPAK6组A549细胞骨架应力纤维均明显减少，肌动蛋白皱缩，表明PAK6可能通过细胞骨架的重构影响其侵袭和迁移能力。

本研究通过体外实验发现PAK6在非小细胞肺癌组织及A549细胞中表达量显著升高，并发现PAK6通过细胞骨架的重构影响非小细胞肺癌的侵袭、迁移能力。我们将在下一步研究中明确PAK6影响非小细胞肺癌侵袭及迁移能力的分子机制。

[1] Lee SH, Eom M, Lee SJ, et al. βPix-enhanced p38 activation by Cdc42/Rac/PAK/MKK3/6-mediated pathway. Implication in the regulation of membrane ruffling[J]. J Biol Chem, 2001, 276(27): 25066-25072.

[2] Wen X, Li X, Liao B, et al. Knockdown of p21-activated kinase inhibits prostate cancer growth and enhances chemosensitivity to docetaxel[J]. Urology, 2009, 73(6): 1407-1411.

[3] 蔡松旺，李小娟，陈锐涵，等. 微小RNA-23a-p21活化激酶6通路对前列腺癌细胞迁移与侵袭能力的影响[J]. 中华实验外科杂志,2012, 29(7): 1360-1362.

[4] Chen L, Yang S, Jakoncic J, et al. Migrastatin analogues target fascin to block tumour metastasis[J]. Nature, 2010, 464(7291): 1062-1066.

[5] 王 华，周 滨，郭 星，等. 人参皂苷Rh2对肝癌SMMC-7721细胞增殖和细胞骨架的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(6): 1226-1229.

[6] 王占胜，韩雅玲，康 建，等. E1A激活基因阻遏子促进人血管内皮细胞VEGF分泌和单层通透性增加[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(1): 37-41.

Effectsofp21-activatedkinase6oninvasionandmigrationofhumannon-small-celllungcancerA549cells

CAI Song-wang1, XIE Die-lai2, WENG Yi-min1, WEN Xing-qiao3, ZHANG Jun-hang1

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery,2DepartmentofRadiology,3DepartmentofUrinarySurgery,theThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:songwangcai@yahoo.com)

AIM: To investigate the effects of p21-activated kinase 6 (PAK6) on the invasive and migratory abilities of human non-small-cell lung cancer A549 cells.METHODSThe expression of PAK6 mRNA in A549 cells, human bronchial epithelial (HBE) cells, non-small-cell lung cancer tissues and paired adjacent non-tumor tissues was measured by real-time PCR. After A549 cells were transfected with siRNA-PAK6 (siPAK6) or negative control (NC) for 48 h, the expression of PAK6 at mRNA and protein levels was measured by real-time PCR and Western blotting, respectively. The invasion and migration of A549 cells were detected by Matrigel invasion assay and Transwell migration assay. The cytoskeletal changes were observed with FITC-phalloidin staining under confocal microscope.RESULTSThe level of PAK6 mRNA in A549 cells was higher than that in HBE cells (3.50±1.16vs1.12±0.42,P<0.05). The level of PAK6 mRNA in non-small-cell lung cancer tissues was higher than that in paired adjacent non-tumor tissues (5.13±1.33vs1.08±0.37,P<0.05). The expression of PAK6 protein decreased by 72% in A549 cells transfected with siPAK6 (P<0.05), and the level of PAK6 mRNA significantly decreased in A549 cells transfected with siPAK6 (3.72±0.75vs0.69±0.21,P<0.05). Matrigel invasion assay and Transwell migration assay demonstrated that knockdown ofPAK6 markedly attenuated the invasion and migration of A549 cells (P<0.05). The cytoskeletal actin remodeling and reduction of stress fibers in A549 cells transfected with siPAK6 were observed under confocal microscope.CONCLUSIONPAK6 may affect the invasive and migratory abilities of non-small-cell lung cancer cells by cytoskeletal actin remodeling.

p21-activated kinase 6; Non-small-cell lung cancer; Neoplasm invasiveness; Cell migration; Cytoskeleton

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1637- 04

2013- 01- 09

2013- 07- 10

广东省科技计划(No.2012B031800063)；广东省医学科研基金资助项目(No.B2012111)

△通迅作者 Tel: 020-85252230; E-mail: songwangcai@yahoo.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.017