徐文明， 郭润民， 陈景福， 陈 刚， 郭瑞鲜， 冯鉴强， 廖新学

(1中山大学附属第一医院黄埔院区内科，广东 广州 510700； 2广东医学院附属医院心内科，广东 湛江 524001；3中山大学中山医学院生理学教研室，广东 广州 510080；中山大学附属第一医院 4心血管内科， 5高血压血管病科，广东 广州 510080)

硫化氢通过调控NF-κB通路抑制阿霉素引起的心肌细胞炎症与细胞毒性*

徐文明1， 郭润民2， 陈景福2， 陈 刚1， 郭瑞鲜3， 冯鉴强3， 廖新学4，5△

(1中山大学附属第一医院黄埔院区内科，广东 广州 510700；2广东医学院附属医院心内科，广东 湛江 524001；3中山大学中山医学院生理学教研室，广东 广州 510080；中山大学附属第一医院4心血管内科，5高血压血管病科，广东 广州 510080)

目的探讨硫化氢(H2S)是否通过调控核因子κB(NF-κB)通路抑制阿霉素(DOX)引起的心肌细胞炎症反应与细胞毒性。方法应用Western blotting法测定NF-κB p65表达；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平；细胞计数盒(CCK-8)检测细胞存活率，Hoechst 33258核染色法检测凋亡细胞的形态学及数量的变化。结果应用5 μmol/L DOX处理H9c2心肌细胞明显上调磷酸化NF-κB p65(p-p65)表达水平，并引起炎症反应和细胞毒性，表现为IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平升高、凋亡细胞数量增多及细胞存活率降低。400 μmol/L NaHS(H2S供体)预处理30 min能显著抑制DOX对心肌细胞p-p65表达的上调作用，并减轻DOX引起的炎症反应和细胞损伤，使IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平下降、凋亡细胞数量降低及细胞存活率升高。与NaHS的作用相似，NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC,100 μmol/L)预处理也能阻断DOX引起的心肌炎症反应和细胞毒性。IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra, 20 μg/L)与DOX共处理能拮抗DOX对心肌细胞NF-κB p65的激活作用及细胞毒性作用。结论在DOX引起的心肌细胞炎症中，NF-κB通路与IL-1β之间存在正的相互作用；H2S可通过抑制NF-κB通路保护心肌细胞对抗DOX引起的炎症反应与细胞毒性。

硫化氢； NF-κB； 阿霉素； 心肌细胞； 炎症反应

阿霉素(又称多柔比星，doxorubicin， DOX)是一种临床上常用的化疗药物，用于治疗白血病及一些实体癌肿，如乳腺癌、卵巢癌和小细胞肺癌等。然而，由于它能引起严重的剂量依赖性的急性或慢性心肌毒性(cardiotoxicity)[1-2],故限制了其在临床上的应用。DOX引起心肌毒性的机制是多方面的，其中的一个病理生理机制是诱发心肌细胞炎症反应。Sauter等[3]报道，DOX引起一些炎症细胞因子，如白细胞介素 (interleukin, IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α， TNF-α)的分泌增多。值得注意的是，TNF-α能激活核因子 κB(nuclear factor-κB, NF-κB)[4]。柔红霉素(daunorubicin,DOX类似物)能增强TNF-α对NF-κB的激活作用[5]，提示NF-κB可能也参与DOX引起的炎症。但是，在DOX引起的心肌细胞炎症中，NF-κB通路的作用如何?尚未完全清楚。

NF-κB是一个二聚体转录因子，具有调节与应激反应(包括炎症、氧化应激、凋亡等)相关的基因的作用，并参与心肌的炎症与坏死过程[6]。最近，我们证实，第3种内源性气体信号分子——硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)能通过抑制NF-κB/环氧化酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)通路保护人皮肤角质形成细胞(HaCat细胞)对抗化学性低氧引起的炎症[7],并能保护心肌细胞对抗DOX心肌毒性[8]。因此，我们推测外源性H2S可通过调控NF-κB通路对抗DOX引起的心肌细胞炎症。为了验证上述推测，本研究应用5 μmol/L DOX处理H9c2心肌细胞建立DOX心肌毒性实验模型[8]，重点探讨：(1)NF-κB在DOX引起的心肌细胞炎症中的作用；(2)硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS；H2S供体)能否通过调控NF-κB通路对抗DOX引起的心肌细胞炎症反应。

材 料 和 方 法

1材料

DOX和NaHS购自Sigma-Aldrich，细胞计数试剂盒8(Cell Counter Kit-8, CCK-8)由Dojindo Lab提供，蛋白预览marker(10～170 kD)购自Fermenta，DMEM-F12 培养基以及特级胎牛血清购自Gibco BRL，抗NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-p65)抗体及吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC;NF-κB 抑制剂) 购自Cell Signaling Technology。IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)购自ProSpec。IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

2细胞培养与实验分组

H9c2心肌细胞来源于大鼠胚胎期心脏组织，培养于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基，置于5% CO2、37 ℃的温箱条件下培养。实验分8组：(1)正常对照组；(2)DOX损伤组：应用5 μmol/L DOX处理H9c2心肌细胞；(3)PDTC预处理+DOX损伤组：100 μmol/L PDTC作用心肌细胞30 min，撤去，用PBS洗2次，接着应用5 μmol/L DOX 作用24 h;(4)NaHS预处理+DOX损伤组：400 μmol/L NaHS作用H9c2 心肌细胞30 min, 撤去，用PBS洗2次，接着应用5 μmol/L DOX 作用24 h;(5)IL-1Ra+DOX共处理组：参考Byrne等[9]介绍的方法应用20 μg/L IL-1β受体阻断剂IL-1 Ra与DOX共同处理H9c2心肌细胞24 h；(6)PDTC组：单独应用100 μmol/L PDTC作用心肌细胞30 min；(7)NaHS组：单独应用400 μmol/L NaHS作用H9c2 心肌细胞30 min；(8)IL-1Ra组：单独应用20 μg/L IL-1Ra处理H9c2细胞24 h。

3细胞存活率的测定

H9c2 心肌细胞接种于96孔培养板中，当细胞生长到培养孔的约80%面积时， 根据实验需要进行不同的处理，每个处理因素设4个复孔。终止培养后，每孔加入10 μL CCK-8，轻摇，37 ℃孵育2 h，用酶标仪(λ=450 nm)记录各孔的吸光度(A)。取4孔A值的平均数，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=处理组A/对照组A×100%，重复3次。

4Hoechst33258核染色法观察凋亡细胞形态和数量改变

H9c2 心肌细胞按分组要求(1)正常对照组；(2)DOX损伤组；(3)NaHS预处理+DOX损伤组;(4)NaHS组)进行相应的处理后，小心弃去培养基，用PBS 洗1遍，4% 多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗后，加入5 mg /L Hoechst 33258 试剂，室温轻摇30 min。在荧光显微镜(BX50-FLA, Olympus) 下摄片，染色质均匀分布，核被染成均匀蓝色的细胞定为正常细胞，核呈浓缩、碎裂的明亮蓝色细胞定为凋亡细胞，随机选取视野在荧光显微镜下摄片。

5ELISA法测定IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平

采用双抗体夹心ABC-ELISA 法检测培养基中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。H9c2细胞接种于96孔培养板中，当80%融合时，分别给予不同的条件处理培养基，每组3个复孔。处理完成后，取100 μL培养基加入预先用IL-1β、IL-6 和TNF-α抗体包被的酶标板中，37 ℃孵育90 min，然后吸出培养基，加入IL-1β、IL-6和TNF-α抗体继续孵育60 min，经TBS漂洗3次，加入生物素标记的Ⅱ抗，反应30 min，采用TMB 法显色，经终止液终止反应后，用酶标仪(Multiscan MK3，Thermo Labsystems)记录450 nm 波长处的吸光度。取3 孔标准化处理后的A值进行统计分析。

6Westernblotting法检测NF-κB的表达水平

H9c2心肌细胞接种于60 mm培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，用预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液，4 ℃静置30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5 h，随后加入抗p65和p-p65抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜，用TBST洗3次，10 min/次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，暗室曝光到X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。

7统计学处理

用SPSS 13.0统计软件分析，数据用均数±标准误(mean±SEM)表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较按LSD-t检验进行，检验水准P<0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1硫化氢抑制DOX对心肌细胞磷酸化NF-κBp65表达的上调作用

应用5 μmol/L DOX处理H9c2细胞90 min能明显增加p-p65的表达水平，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。但是，在DOX处理心肌细胞前，应用400 μmol/L NaHS预处理30 min能显著抑制DOX对p-p65表达的上调作用(P<0.01)。单独应用400 μmol/L NaHS处理心肌细胞30 min对p-p65的表达无明显的影响，见图1。

Figure 1. Hydrogen sulfide inhibited doxorubicin (DOX)-induced up-regulation of phosphorylated NF-κB p65 (p-p65) expression in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

图1硫化氢抑制DOX对心肌细胞磷酸化NF-κBp65表达的上调作用

2硫化氢和NF-κB抑制剂抑制DOX对心肌细胞IL-1β分泌的促进作用

图2显示，应用5 μmol/L DOX处理H9c2细胞24 h可明显增加IL-1β的分泌水平，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。400 μmol/L NaHS预处理30 min能显著阻断DOX对心肌细胞IL-1β分泌的促进作用(P<0.01)。与NaHS的作用相似，在DOX处理心肌细胞前，应用100 μmol/L PDTC预处理30 min也能抑制DOX对IL-1β分泌的促进作用(P<0.01)。单独NaHS 或PDTC预处理本身不影响IL-1β的基础分泌水平。上述结果提示H2S可通过抑制NF-κB通路继而阻断DOX对心肌细胞IL-1β分泌的促进作用。

3硫化氢和NF-κB抑制剂抑制DOX对心肌细胞IL-6分泌的促进作用

图3显示，应用5 μmol/L DOX处理H9c2细胞24 h可引起IL-1β的分泌明显增多，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。在DOX处理心肌细胞前，分别应用400 μmol/L NaHS或100 μmol/L PDTC预处理30 min均能减弱DOX对心肌细胞IL-6分泌的促进作用(P<0.01)。单独NaHS 或PDTC预处理本身对心肌细胞IL-6的基础分泌无明显影响。上述结果提示，H2S可通过抑制NF-κB通路继而抑制DOX对心肌细胞IL-6分泌的促进作用。

Figure 2. Hydrogen sulfide and NF-κB inhibitor PDTC attenuated doxorubicin(DOX)-induced over-secretion of IL-1β in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

图2硫化氢和NF-κB抑制剂抑制DOX对心肌细胞IL-1β分泌的促进作用

Figure 3. Hydrogen sulfide and NF-κB inhibitor PDTC blocked doxorubicin(DOX)-induced increase in IL-6 secretion in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

图3硫化氢和NF-κB抑制剂抑制DOX对心肌细胞IL-6分泌的促进作用

4硫化氢和NF-κB抑制剂阻断DOX对心肌细胞TNF-α分泌的促进作用

图4显示，应用5 μmol/L DOX处理H9c2细胞24 h，可明显地增加TNF-α的分泌水平，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。在DOX处理心肌细胞前，分别应用400 μmol/L NaHS或100 μmol/L PDTC预处理30 min可显著阻断DOX对心肌细胞TNF-α分泌的促进作用(P<0.01)。单独NaHS 或PDTC预处理本身对心肌细胞TNF-α的基础分泌无明显的影响。

5硫化氢抑制DOX引起的心肌细胞凋亡

Hoechst 33258 核染色检测结果显示，正常H9c2心肌细胞染色质分布均匀，为弥散均匀的低密度荧光(图5A)。但是，经5 μmol/L DOX处理24 h后，未经硫化氢预处理的H9c2心肌细胞呈现典型的凋亡特征，即细胞核呈现浓缩致密的固缩形态或颗粒荧光(图5B)。400 μmol/L NaHS预处理本身对H9c2心肌细胞的凋亡无明显的影响(图5D)，但是，NaHS预处理能明显地对抗5 μmol/L DOX对心肌细胞的致凋亡作用，使呈现浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞数量明显减少(图5C)。

Figure 4. Hydrogen sulfide and NF-κB inhibitor PDTC reduced doxorubicin(DOX)-induced up-regulation of TNF-α secretion in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

图4硫化氢和NF-κB抑制剂抑制DOX对心肌细胞TNF-α分泌的上调作用

6IL-1β受体拮抗剂抑制DOX对心肌细胞p-p65表达的上调作用

图6显示，IL-1Ra与DOX共处理可明显地减弱DOX对p-p65表达的上调作用。单独IL-1Ra处理H9c2心肌细胞90 min对p-p65的基础表达无明显的作用。结合图2的实验结果，提示在DOX诱发心肌细胞炎症反应中，NF-κB与IL-1β之间存在正的相互作用。

7NF-κB和IL-1β介导DOX引起的心肌细胞毒性

图7显示，应用5 μmol/L DOX处理H9c2心肌细胞24 h可引起细胞毒性，使细胞存活率明显地降低，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。在DOX处理心肌细胞前，应用100 μmol/L PDTC预处理30 min可抑制DOX引起的细胞毒性，使细胞存活率明显升高(P<0.01)。另一方面，应用 20 μg/L IL-1Ra与DOX共同处理H9c2细胞24 h也能拮抗DOX引起的细胞毒性(P<0.01)。单独应用PDTC或IL-1Ra处理心肌细胞对细胞存活率无明显影响。上述结果提示NF-κB和IL-1β参与DOX引起的心肌细胞毒性。

Figure 5. Inhibitory effect of hydrogen sulfide on doxorubicin(DOX)-induced apoptosis of H9c2 cells (Hoechst staining,×400).A:control group;B:DOX group; C:DOX+NaHs group;D:NaHS group. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

图5硫化氢抑制DOX对心肌细胞的致凋亡作用

Figure 6. Antagonist of IL-1β receptor (IL-1Ra) depressed doxorubicin(DOX)-induced up-regulation of phosphorulated NF-κB p65 (p-p65) expression level in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

图6IL-1β受体拮抗剂抑制DOX对心肌细胞p-p65表达的上调作用

Figure 7. Both NF-κB and IL-1β mediated doxorubicin(DOX)-induced cytotoxicity in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

图7NF-κB和IL-1β介导DOX引起的心肌细胞毒性

讨 论

近年，炎症在DOX心肌毒性中的作用日益受到重视。本研究在DOX处理H9c2细胞的实验模型中观察到，DOX能引起心肌细胞炎症反应，表现为前炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌明显增多，这与一些报道的结果一致[3，10]。有报道指出，DOX可能是激活癌细胞NF-κB通路的诱导者[11]，因此，本研究观察DOX对心肌细胞p-NF-κB p65表达的影响。NF-κB被认为是控制炎症反应的核心因子。NF-κB家族主要由5个亚单位：即NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、p65(RelA)、RelB和c-Rel构成[12]。其中p65是NF-κB发挥功能的必需亚单位。与前文[11]的结果相似，本研究观察到，DOX能明显地上调H9c2细胞p-NF-κB p65的表达水平，提示DOX能激活NF-κB通路。进一步的研究还发现，NF-κB抑制剂PDTC能抑制DOX对心肌细胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的上调作用，提示激活NF-κB通路可能是DOX引起心肌细胞炎症反应的机制之一。

IL-1β被认为是一种在免疫和炎症反应调节中起重要作用的细胞因子,参与DOX对IL-6分泌的促进作用[3]。为了探讨在DOX诱导的心肌细胞炎症中，IL-1β与NF-κB之间是否存在相互作用，本研究观察了IL-1β受体拮抗剂IL-1Ra对DOX引起NF-κB激活作用的影响。结果表明，IL-1Ra能拮抗DOX对p-p65表达的上调作用，结合上述的结果(PDTC抑制DOX对IL-1β分泌的促进作用)，提示IL-1β与NF-κB之间可能存在正的相互作用。有报道指出，IL-1可持续地激活蛋白激酶，继而导致NF-κB核转移，引起细胞死亡[13]。Ing等[14]也报道，IL-1可通过促进一氧化氮的生成而引起心肌细胞死亡。因此，这种相互作用可加重DOX引起的心肌炎症反应与损伤，可能是DOX诱发心肌细胞炎症的一个新机制，今后需进一步深入研究。

H2S是继一氧化碳和一氧化氮之后被发现的第3种内源性气体信号分子。近年，越来越多的研究证实，H2S具有心肌保护作用[8,13-16]。值得注意的是，DOX能抑制心肌细胞内源性H2S的生成[8]，外源性H2S能保护心肌细胞，对抗DOX引起的心肌毒性[8,15]。本研究进一步证实，NaHS在抑制DOX细胞毒性及细胞凋亡的同时，能阻断DOX对IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的上调作用，提示H2S能抑制DOX引起的心肌炎症反应，并发现外源性H2S也能抑制DOX对NF-κB通路的激活作用，提示通过抑制NF-κB通路可能是H2S抑制DOX诱导的心肌炎症的作用机制之一。最近，我们证实，H2S可通过其抗氧化作用抑制NF-κB通路，继而抑制化学性缺氧引起的HaCat细胞炎症[7]。因此，H2S是否通过抗氧化机制抑制NF-κB通路继而抑制DOX引起的心肌细胞炎症，尚需进一步探讨。

[1] Scully RE, Lipshultz SE. Anthracycline cardiotoxicity in long-term survivors of childhood cancer[J]. Cardiovasc Toxicol, 2007, 7(2):122-128.

[2] Hrdina R, Gersl V, KlimtovI, et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity[J].Acta Medica (Hradec Kralove) , 2000, 43(3):75-82.

[3] Sauter KA, Wood LJ, Wong J, et al. Doxorubicin and daunorubicin induce processing and release of interleukin-1beta through activation of the NLRP3 inflammasome[J]. Cancer Biol Ther, 2011,11(12):1008-1016.

[4] Riganti C, Doublier S, Costamagna C, et al. Activation of nuclear factor-κB pathway by simvastatin and RhoA silencing increases doxorubicin cytotoxicity in human colon cancer HT29 cells[J]. Mol Pharmacol, 2008, 74(2):476-484.

[5] Boland MP, Foster SJ, O’Neill LA. Daunorubicin activates NFκB and induces κB-dependent gene expression in HL-60 promyelocytic and Jurkat T lymphoma cells[J]. J Biol Chem, 1997,272(20):12952-12960.

[6] Shi Y, Moon M, Dawood S, et al. Mechanisms and management of doxorubicin cardiotoxicity[J].Herz, 2011,36(4):296-305.

[7] Yang C, Yang Z, Zhang M, et al.Hydrogen sulfide protects against chemical hypoxia-induced cytotoxicity and inflammation in HaCaT cells through inhibition of ROS/NF-κB/COX-2 pathway[J]. PLoS One, 2011,6(7):e21971.

[8] Wang XY, Yang CT, Zheng DD, et al. Hydrogen sulfide protects H9c2 cells against doxorubicin-induced cardiotoxicity through inhibition of endoplasmic reticulum stress[J]. Mol Cell Biochem, 2012,363(1-2):419-426.

[9] Byrne LS, Peng J, Sarkar S, et al. Interleukin-1 beta-induced up-regulation of opioid receptors in the untreated and morphine-desensitized U87 MG human astrocytoma cells[J]. J Neuroinflammation, 2012,9: 252.

[10] Riad A, Bien S, Westermann D, et al. Pretreatment with statin attenuates the cardiotoxicity of Doxorubicin in mice[J]. Cancer Res, 2009,69(2):695-699.

[11] Yu HG, Ai YW, Yu LL, et al. Phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway plays an important role in chemoresistance of gastric cancer cells against etoposide and doxorubicin induced cell death[J]. Int J Cancer, 2008,122(2):433-443.

[12] Abd-El-Aleem SA, Ferguson MW, Appleton I, et al.Expression of cyclooxygenase isoforms in normal human skin and chronic venous ulcers[J]. J Pathol, 2001,195(5):616-623.

[13] Schreck R, Rieber P, Baeuerle PA. Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-kappa B transcription factor and HIV-1[J]. EMBO J,1991,10(8): 2247-2258.

[14] Ing DJ, Zang J, Dzau VJ, et al. Modulation of cytokine-induced cardiac myocyte apoptosis by nitric oxide, Bak, and Bcl-x[J]. Circ Res,1999,84(1): 21-33.

[15] 李建平, 杨春涛, 杨战利, 等.CFTR氯通道在硫化氢诱导的心肌保护及细胞增殖中的作用[J].中国病理生理杂志, 2009, 25(6): 1070-1075.

[16] 苏钰雯, 杜军保, 韩 薇, 等.硫化氢供体对阿霉素心肌病大鼠氧化应激作用的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2008, 24(8): 1469-1474.

Hydrogensulfideinhibitsdoxorubicin-inducedinflammationandcytotoxicityinratcardiomyocytesbymodulatingactivationofNF-κBpathway

XU Wen-ming1, GUO Run-ming2, CHEN Jing-fu2, CHEN Gang1, GUO Rui-xian3, FENG Jian-qiang3, LIAO Xin-xue4,5

(1DepartmentofInternalMedicine,RegionofHuangpu,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China;2DepartmentofCardiology,AffiliatedHospital,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China;3DepartmentofPhysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;4DepartmentofCardiovasology,5DepartmentofHypertension&VascularDiseases,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:liaoxinx@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate whether hydrogen sulfide (H2S) attenuates doxorubicin (DOX)-induced inflammation and cytotoxicity in rat cardiomyocytes (H9c2 cells) by modulating nuclear factor κB (NF-κB) pathway.METHODSThe expression of NF-κB p65 was measured by western blotting. The secretion levels of interleukin (IL)-1β, IL-6 and tumor necrosis factor α (TNF-α) were tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Cell viability was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. Hoechst 33258 nuclear staining was used to detect the morphological changes and number of apoptotic cells.RESULTSTreatment of H9c2 cells with 5 μmol/L DOX significantly up-regulated the expression level of phosphorylated NF-κB p65 (p-p65), and induced inflammation and cytotoxicity, as evidenced by increases in secretion levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α and number of apoptotic cells as well as a decrease in cell viability. Pretreatment of H9c2 cells with 400 μmol/L NaHS (a donor of H2S) for 30 min markedly depressed the up-regulation of p-p65 expression induced by DOX. In addition, NaHS pretreatment also reduced DOX-induced inflammatory response and injury, leading to decreases in IL-1β, IL-6 and TNF-α secretion and number of apoptotic cells as well as an increase in cell viability. Similar to the effect of NaHS, pretreatment with 100 μmol/L pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), an inhibitor of NF-κB, also blocked DOX-induced cardiac inflammation and cytotoxicity. Co-administration of IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) and DOX reduced DOX-induced activation of NF-κB and cytotoxicity in H9c2 cells.CONCLUSIONDuring the DOX-induced cardiomyocyte inflammation, there is positive interaction between NF-κB pathway and IL-1β. H2S may protect cardiomyocytes against DOX-induced inflammatory response and cytotoxicity by inhibiting NF-κB pathway.

Hydrogen sulfide; NF-kappa B; Doxorubicin; Cardiomyocytes; Inflammatory response

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1561- 06

2013- 06- 24

2013- 08- 28

国家自然科学基金资助项目(No.81270296)；广东省科技计划(No.2012B031800358)

△通讯作者 Tel: 020-87332628; E-mail: liaoxinx@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.004