吴江渝，董兴梅，肖 夏

（武汉工程大学材料科学与工程学院，湖北 武汉 430074）

0 引 言

叶酸（Folic acid，FA）是一种常见的B族维生素，又称蝶酰谷氨酸.叶酸是人体中不可或缺的一种维生素，叶酸缺乏会引起巨红细胞贫血症，严重时甚至会引起白细胞减少症.此外，由于肿瘤细胞表面具有大量表达的叶酸受体，叶酸还具有抗肿瘤靶向的作用.树形分子由于具有纳米尺度、高水溶性、单分散性以及结构可调性，使其特别适合用作抗癌药物和成像药物的输送载体［1－2］.相比于脂质体和两性分子载体化合物，树形分子支架中的共价键提供了更稳定的载体结构，使之能够经受住生理条件的变化，并能保护药物分子不被快速地分解，保证其发生特定的药物释放，促使药物分子在肿瘤细胞中保持一定的药效浓度［3］.研究发现基于树形分子的药物控制释放体系相比于线性聚合物载体（例如PEG）具有更优越的药物载体性能，这是由于树形分子的纳米尺寸和在溶液中紧密的球面结构所引起的［4］.

叶酸与癌细胞表面的叶酸受体的高度亲和力使得叶酸成为了一种识别肿瘤细胞的靶向分子［5－6］.叶酸分子中含有两个羧酸基团：α－羧基和γ－羧基.研究发现利用叶酸的γ－羧基接枝到树形大分子上得到的树形分子－叶酸化合物与细胞表面仍具有较高的亲和力［7］.利用叶酸对肿瘤细胞的靶向作用和树形分子可以作为药物载体的特性，可向肿瘤组织靶向性输送抗癌治疗药物以及放射显影剂等.基于树形分子叶酸靶向的药物释放体系相比于非靶向树形分子和纯抗癌药物在癌细胞中表现出更高的药物积累量和更好的治疗效果［7］.

本文采用发散法合成以乙二胺为核的聚酰胺胺（Polyamidoamine，PAMAM）树形分子.将叶酸通过两个连续的反应步骤接枝到树形分子表面，得到树形分子－叶酸化合物，并对所得到的一系列树形分子－叶酸化合物进行了红外光谱以及紫外－可见光谱的表征.这种具有靶向性的树形分子药物载体材料对提高抗癌药物的有效性提供了可能.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

叶酸、醋酸、醋酸钠、浓盐酸、氢氧化钠、吡啶购自国药集团上海化学试剂公司，N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N，N－二环己基碳酰亚胺（DCC）、乙二胺、丙烯酸甲酯购自国药集团化学试剂有限公司，乙二胺和丙烯酸甲酯使用前重蒸.

PB－10pH计（Sartoriuos公司）、85－2型恒温磁力搅拌器（上海市易友仪器有限公司）、RE－52型旋转蒸发器（上海市嘉鹏科技有限公司）、TU－1900双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、Nicolet is10红外光谱仪（美国Nicolet公司）.

1.2 实验方案

在实验的过程中，乙二胺为核的PAMAM树形分子采用经典的发散合成法制得.树形分子－叶酸化合物的实验步骤如图1所示.

图1 PAMAM－FA合成路线图Fig.1 Synthesis of PAMAM－FA

1.2.1 叶酸标准曲线实验 量取冰醋酸5.7g加入1000mL容量瓶中，向其加入91g醋酸钠，加入蒸馏水定容至刻度线.震荡至其完全溶解.即配成了质量浓度为0.1mol／L且pH＝5.8的醋酸－醋酸钠缓冲溶液.以此缓冲液为溶剂配制质量浓度分别为0.001、0.0025、0.0050、0.0075、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030mg／mL的叶酸标准溶液，并测定其在吸收波长λ＝280nm处的吸光度.

1.2.2 PAMAM树形分子的合成 PAMAM树形分子的合成通过两步反应得到：迈克尔加成反应和酰胺化反应.首先，以乙二胺为核与过量的丙烯酸甲酯反应，伯胺基与双键加成得到末端为酯基的半代树形分子.半代树形分子与过量的乙二胺反应得到末端为伯胺基的整代树形分子.如此交替重复反应得到高代树形分子［8］.实验得到0至4代的树形分子（G0－PAMAM末端含4个氨基，G1－PAMAM末端含8个氨基，依此类推）.

1.2.3 叶酸活化酯的制备 称取2.512g叶酸于100mL圆底烧瓶中，加入70mL DMSO搅拌使其完全溶解.向其中加入1.175g的DCC和715mg的NHS.25℃下剧烈搅拌反应5h，停止反应.将反应液过滤除去白色固体副产物DCU，得到叶酸活化酯溶液.

1.2.4 树形分子－叶酸化合物的制备 分别称取 G0－PAMAM 120mg、G1－PAMAM 130mg、G2－PAMAM 118mg、G3－PAMAM 80mg、G4－PAMAM 106mg溶于5mL DMSO中，搅拌状态下分别向其逐滴加入叶酸活化酯溶液7、9、12、15、16mL.加入两滴新蒸吡啶做催化剂.剧烈搅拌反应两天.将0代和1代反应粗产物用乙醚沉降，得到鹅黄色絮状沉淀，冷冻干燥即得到黄褐色固体粉末G0－PAMAM－FA、G1－PAMAM－FA.将2、3、4代反应粗产物用截留分子量3500的透析袋透析提纯.冷冻干燥得到黄褐色固体粉末 G2－PAMAM－FA、G3－PAMAM－FA和G4－PAMAM－FA.

2 结果与讨论

2.1 叶酸紫外吸收标准曲线的绘制

测定不同浓度叶酸标准溶液在吸收波长λ＝280nm处的吸光度，绘制出吸光度随浓度变化的紫外吸收叶酸标准曲线，如图2.

图2 叶酸标准曲线Fig.2 Standard absorption curve of folic acid

2.2 催化剂的选择

在叶酸的活化反应中，尝试了两种催化剂方案：一种是采用NHS／EDC作为催化剂，反应过程中副反应比较少，几乎没有副产物生成，但是反应后处理不易.另一种是采用NHS／DCC做催化剂.反应过程迅速，有少量白色不溶副产物DCU生成，但易分离.因此实验中选择NHS／DCC作为叶酸活化反应的催化剂.叶酸活化酯与树形分子的反应是一种酰胺化反应，反应中常用的催化剂有吡啶和三乙胺.实验发现吡啶在实验进程中催化活性明显高于三乙胺，故选择吡啶作为反应的催化剂.

2.3 红外表征（IR）

图3为0代到4代树形分子－叶酸化合物的红外光谱图.根据分析可以发现，在3300～3500 cm－1处为N－H的伸缩振动吸收峰.在3000～3100cm－1处为叶酸分子中苯环中C－H伸缩振动吸收峰.由于该峰较弱，它常被附近的强吸收峰所覆盖.在波数为1600～1450cm－1之间的吸收峰是苯环骨架上C＝C的伸缩振动，说明存在明显的苯环结构.1700cm－1附近的吸收峰为C＝O伸缩振动峰.在819cm－1和641cm－1出现叶酸中苯环和杂环－CH的面外弯曲振动吸收特征峰.通过判断这些基团的存在，可以推知叶酸分子已经和PAMAM树形分子反应，叶酸分子成功接枝到树形分子上.

图3 各代PAMAM－FA化合物的红外光谱图Fig.3 FT－IR spectra of PAMAM－FA compounds

2.4 紫外光谱表征

用pH值为5.8的醋酸－醋酸钠缓冲液作为溶剂分别配制质量浓度为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125mg／mL 的 G0－PAMAM－FA、 G1－PAMAM－FA、 G2－PAMAMFA、G3－PAMAM－FA、G4－PAMAM－FA 溶 液，并用紫外分光光度计测定其紫外吸收光谱.图4至图8为不同浓度的各代树形分子－叶酸化合物的紫外吸收光谱图.从图中可以发现，树形分子－叶酸化合物在285nm处的吸收值随着该化合物的浓度的增加而增加.通过对照叶酸标准曲线可以计算出相应溶液中的叶酸浓度，从而进一步计算出各代树形分子与叶酸的平均接枝率.计算可得平均每个G0－PAMAM树形分子接枝约1.25个叶酸分子，G0－PAMAM表面有4个末端氨基，因此G0－PAMAM－FA的平均接枝率约为31%.

图4 G0－PAMAM－FA化合物的紫外吸收谱图Fig.4 UV－spectra of G0－PAMAM－FA at different concentrations

图5 G1－PAMAM－FA化合物的紫外吸收谱图Fig.5 UV－spectra of G1－PAMAM－FA at different concentrations

图6 G2－PAMAM－FA化合物的紫外吸收谱图Fig.6 UV－spectra of G2－PAMAM－FA at different concentrations

图7 G3－PAMAM－FA化合物的紫外吸收谱图Fig.7 UV－spectra of G3－PAMAM－FA at different concentrations

图8 G4－PAMAM－FA化合物的紫外吸收谱图Fig.8 UV－spectra of G4－PAMAM－FA at different concentrations

依此类推计算可知，G1－PAMAM－FA的平均接枝率约为28%，G2－PAMAM－FA的平均接枝率约为36%，G3－PAMAM－FA的接枝率约为15%，而G4－PAMAM－FA的接枝率大约为10%.第3代和4代树形分子的叶酸接枝率较低的原因可能是由于树形分子表面基团增多，空间位阻增大，同时接上部分叶酸分子后空间位阻效应进一步变大，阻碍了其他氨基与叶酸分子的反应.

3 结 语

PAMAM树形大分子作为一种优良的载体广泛用于药物控制释放，而引入具有肿瘤靶向功能的叶酸分子作为靶向单元可以提高药物分子对肿瘤细胞的选择性.本文对乙二胺为核的PAMAM树形大分子进行叶酸接枝修饰研究.通过一系列的反应，成功将叶酸分子接枝到树形大分子，并对所合成的系列树形分子－叶酸化合物进行了表征.我们期望这种具有靶向性的药物载体能够在癌症治疗中得到更广泛的应用.

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［5］徐海娥，闫翠娥.叶酸和聚乙二醇接枝作基因载体用壳聚糖的合成与表征［J］.化学研究与应用，2007，19（1）：60－63.

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［7］Zhang Y Q，Sun Y H，Xu X P，et al.Synthesis，Biodistribution，and Microsingle Photon Emission Computed Tomography（SPECT）Imaging Study of Technetium－99mLabeled PEGylated Dendrimer Poly（amidoamine） （PAMAM ）－Folic Acid Conjugates［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2010，53：3262－3272.

［8］姜铁坤，吴江渝，肖夏，等.微波条件下树形分子核单元的合成及优化［J］.武汉工程大学学报，2010，32（11）：70－73.