刘玲，吴正奇，王雄，万端极

（1.湖北工业大学化学与环境工程学院，湖北 武汉430068；2.湖北工业大学膜技术研究所，湖北 武汉430068）

0 引言

麦角固醇又称麦角甾醇，是脂溶性维生素D2的前体，当受到紫外线照射时，分子中4个碳环中的一个发生断裂，变成维生素D2；此外还可作为可的松、黄体酮、芸苔素内酯等物质的生产原料［1].

目前国内外麦角固醇的生产方式有2种，一种是用微生物发酵法，所用菌种有酵母菌、曲霉和青霉等［2-4]，但发酵成本高，不利于大工业化生产.另一种是用醇碱法从菌丝体中皂化提取，即用一定浓度的碱与醇混合液来提取，提取后的上清液再用乙醚萃取得麦角固醇［5-6]，此法在反应和萃取阶段使用了大量的有机溶剂，溶剂回收费用高，生产安全性差.

目前常用的麦角固醇提取纯化方法是用石油醚、乙醇、丙酮等有机溶剂反复萃取提纯［7].有机溶剂用量大，溶剂回收费用高昂、成本居高不下.

本文中采用碱溶液来皂化麦角固醇，将菌丝体中的结合态麦角固醇变为游离态，再酶解，将碱提后渣中的醇溶性蛋白水解为多肽溶于水相，用乙醇萃取可得到纯度较高的麦角固醇产品.本工艺避免了提取和纯化过程中有机溶剂的大量使用，大大减少麦角固醇的生产成本，为麦角固醇的生产开创了一条新生产工艺，同时也为麦角固醇的提纯提供了新方法.

1 实验部分

1.1 材料 青霉素湿菌丝（华北制药有限公司发酵自制）；麦角固醇标准品为Singma公司产品.

木瓜蛋白酶，南宁东恒华道生物科技有限责任公司；碱性蛋白酶，无锡杰能科生物工程有限公司；风味蛋白酶，Novo酶制剂公司；复合蛋白酶，Novo酶制剂公司.

1.2 主要实验仪器 PHS-3C型数显酸度计：杭州奥立龙仪器有限公司；HX1201Z型电子天平：慈溪市天冬衡器厂；H H-4数显恒温水浴锅：金坛市城西晓阳电子仪器厂；JJ-1型精密增力电动搅拌器：江苏晓阳电子仪器厂；TDL-5-A型低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；戴安Ulti Mate3000液相色谱仪：石家庄博莱特仪器有限公司.

1.3 实验方法 设定实验工艺如下：

青霉素湿菌丝体→滤干→碱提→渣→醇提→旋蒸→粗品→加水酶解→过滤→醇提→旋蒸→高纯度麦角固醇.

实验操作：将滤干后的菌丝体，按照物料比1∶15，加入15%的NaOH溶液中，在85℃的水浴锅中提取2 h.碱提后的溶液离心，将渣加入一定量的乙醇溶液常温下提取30 min.醇提液旋蒸可得到麦角固醇粗品.粗品加水加酶进行酶解，过滤，再用乙醇萃取滤纸上的不溶物，提取液旋蒸结晶可得到高浓度的麦角固醇.

1.3.1 碱提 根据工艺选择物料皂化剂比（A），皂化温度（B），用碱浓度（C），皂化时间（D）这4个因素作为考察对象，每个因素各取3个水平，以麦角固醇的皂化收率为指标，通过正交试验，得出最佳皂化条件（表1）.

表1 因素水平表

1.3.2 最佳用酶选择 青霉素菌丝体中各成分含量如下：蛋白42%～43%，麦角固醇0.8%～1.2%，脂肪1.7%～2.0%，无机盐4%，灰分6%～7%，其余为纤维素.在碱提过程中大部分蛋白、脂类物质、无机盐都被除去，渣中主要为纤维素、麦角固醇、灰分和一些不溶于水的蛋白.由于菌丝体中的纤维素不溶于水，所以渣经一次醇提后的溶液中主要是麦角固醇和蛋白.本工艺中酶解的目的是将粗品中的醇溶性蛋白水解为多肽溶于水相，使之与不溶于水的麦角固醇分离达到纯化的目的.

本实验选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶在其各自最佳水解条件下对麦角固醇粗品进行水解，加酶量为3%，以工艺最后得到的产品中麦角固醇的纯度为指标确定最佳用酶种类（表2）.

1.3.3 酶解正交试验 酶解过程中，温度、时间、酶用量是影响酶解效果的主要因素.因此，将温度、时间、酶用量3个因素进行正交实验，因素水平如表3所示.

表2 各种酶的最佳水解条件

表3 酶解正交因素水平表

1.4 分析方法

1.4.1 麦角固醇含量测定和分析方法 采用高效液相色谱法对麦角固醇进行测定：高效液相色谱条件为色谱柱 HC-C18（4.6 mm×150.0 mm，5μm），流动相为纯甲醇，流速1.5 m L／min，检测波长281 nm，柱温30℃，进样量10μL.采用外标法按峰面积进行定量［8-9].另外选取一定量的麦角固醇标准品，用乙醇溶解配制一系列浓度的麦角固醇，在已建立的色谱条件下检测，然后对萃取后的样品进行HPLC分析，计算峰面积并与标准曲线比较，得出所测麦角固醇的含量.

麦角固醇得率计算公式：麦角固醇／%＝［（C×V×N）／W]×100.式中，C为麦角固醇的质量浓度（g／m L），V为溶液体积（m L），N为稀释倍数，W为菌体干质量（g）.

1.4.2 菌丝体中麦角固醇最大含量的确定 利用最后结论3中得出的最佳碱提条件对原料进行最大化提取，得出菌丝体中麦角固醇最大含量为1.2%.

1.4.3 麦角固醇纯度计算方法 麦角固醇纯度／%＝醇提液的体积×醇提液中麦角固醇的浓度／醇提液结晶后的固体质量×100.

2 结果和讨论

2.1 碱提正交试验结果 从正交实验可以看出各因素影响麦角固醇提取率的主次顺序为B＞C＞D＞A.最优条件参数组合为A3B2C3D2，即在物料比1∶15，温度85℃，NaOH浓度为15%，提取时间2 h的条件下，提取率最高（表4）.该条件表中没有，因此需做验证实验，经验证在该条件下提取率为99%.并且通过液相检测结果，计算得粗品中麦角固醇的纯度为34%.

表4 正交试验结果

2.2 水解用酶的选择 由图1可知，碱性蛋白酶的水解效果最好，经该酶水解后制得产品中麦角固醇的纯度可达到67%.因此本实验选取碱性蛋白酶为水解用酶.

图1 各酶在其最佳条件下的水解效果图

2.3 酶解正交实验 由表5的R值看出，各因素对实验结果影响的主次顺序为：E＞G＞F.最优条件参数组合为：E2F2G2，即在温度为45℃，酶解时间2 h，加酶量为2.0%的条件下，为最优工艺条件.该条件表中没有，因此需做验证实验，经验证在该条件下，麦角固醇纯度为70%，产品的得率为95%.所以最优工艺条件为：温度45℃，酶解时间2 h，加酶量为2.0%.

表5 正交试验结果

3 结论

本研究以湿菌体直接加碱皂化及酶法纯化除杂的方法，取代传统工艺中直接加入有机溶剂回流提取以及多种有机溶剂反复萃取提纯的方法，大大降低了有机溶剂用量.以麦角固醇的提取率为指标，通过正交筛选出最佳皂化条件为：物料皂化剂比1∶15，NaOH溶液浓度为15%，温度85℃，皂化时间2 h.以麦角固醇酶解后纯度为指标，选择碱性蛋白酶在温度45℃，时间2 h，加酶量2.0%，p H＝8的条件下酶解.最终产品中麦角固醇的纯度可达到70%，提取率可达到95%.

［1]李莲英，张志敏.维生素 D摄入不足对儿童健康的影响［J].中国儿童保健杂志，1997，5（2）：122.

［2]Wang Tianqi，Li Hanxiang，Wang Manyi，et al.Integrative extraction of ergosterol-（1-3）-α-D-glucan and chitosan fromPenicilliumchrysogenumMycelia［J].Chin Chem Eng，2007，15（5）：725-729.

［3]谭艾娟，宁玮霁，刘爱英，等.红曲霉产麦角固醇液体发酵条件优化［J].食品科技，2008，29（9）：434-436.

［4]江宏文，张毅，李娜，等.酵母菌株产麦角固醇发酵条件优化［J].现代食品科技，2009，25（7）：801-802.

［5]韩庆雪，闻建平，冯国龙.麦角固醇工业化提取工艺研究［J].河北化工，2007，30（2）：42-45.

［6]南春辉.麦角固醇研究进展［J].中国新技术新产品，2009（10）：9-10.

［7]邱从平，张慧波，施立钦，等.麦角固醇提取及分离纯化研究［J].医药卫生论坛，2005（12）：138-139.

［8]孙佰申，周立平，陈旭峰，等.HPLC法测定红曲霉发酵样品中麦角固醇的含量［J].中国食品添加剂，2004（2）：89-92.

［9]李敏，董慧.双水相萃取—高效液相色谱法测定酵母细胞中麦角固醇含量［J].分析试验室，2009，28（11）：119-120.