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吉林省常见的5种委陵菜trnL-F序列比对

2013-10-10王伯川刘春明凌云辉张绍轩吉林大学再生医学科学研究所吉林长春00吉林省肿瘤医院吉林长春00吉林大学中日联谊医院吉林长春00吉林省中医药研究院吉林长春00

吉林医药学院学报 2013年5期
关键词:药典长春吉林省

王伯川,金 刚,刘春明,凌云辉,石 岩,张 本,张绍轩* (.吉林大学再生医学科学研究所,吉林 长春 00;.吉林省肿瘤医院,吉林 长春 00;.吉林大学中日联谊医院,吉林 长春 00;.吉林省中医药研究院,吉林长春 00)

委陵菜(Potentilla chinesis)为蔷薇科委陵菜属植物,具有清热解毒、凉血止痢之功能[1]。由于疗效确切,在《中国药典》历版中均被收载[2]。该属植物较多,仅吉林省境内就有10种之多。由于它们的亲缘关系接近,在同一生境内或不同生境内生长的各个物种间从外观上很难区别,加之所含化学成分接近,因而,用传统的外观鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别很难达到满意效果[3],导致误采、误用,影响疗效。为此,本研究采用trnL-F序列分析,对吉林省地产委陵菜属植物进行鉴别,以弥补上述方法的不足。

1 材料与方法

1.1 样品

委陵菜伏委陵菜,小叉叶委陵菜,霉叶委陵菜,蔓委陵菜为硅胶快速干燥的叶片。分别集于长吉高速公路和长春南湖公园处。均由长春中医药大学邓明鲁教授鉴定(见表1)。

表1 样品的采集地点和时间

1.2 DNA提取

称取0.3 g各样品叶片,置于培养皿中,加水少许,浸泡至充分展开,剪去病斑,用棉球擦拭叶片,去除杂质,再用70%乙醇擦拭叶片表面,然后用超纯水清洗3次,置于超净台上干燥;在液氮中研磨成细粉,然后按说明用北京鼎国植物基因组DNA提取试剂盒提取其总 DNA,溶于适量的超纯水中。取5 μL用1%琼脂糖凝胶电泳,检查DNA质量和数量。

1.3 引物设计

选择trnL通用引物[4],由宝生物(中国 大连)合成,其序列如下:

PCR引物:

trnLF-cF:5'-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3'

trnLK-fR:5'-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3'

测序用引物:

trnLF-cF:5'-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3'

trnLF-dR:5'-GAC TCG ATG GTT CAC GGG ATT CT-3'

trnLK-eF:5'-TCT CGC ATC GAT GAA GAA CG-3'

trnLK-fR:5'-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3'

1.4 DNA扩增

扩增采用50 μL 体系,其中1.3 引物各1 μL,模板各 5 μL,10 × Buffer 5 μL,dNTPs 5 μL,Taq DNA 多聚酶1 μL,超纯净水32 μL。反应条件:94℃预变性5 min。94 ℃ 1 min,55 ℃ 2 min,72℃ 2 min,循环35次。72℃延长循环10 min,4℃保存。

1.5 测序

1.4 PCR产物经Montage PCR Filter Units(Millipore Corporation,U.S.A.)纯化后,进行测序反应。反应采用10 μL体系,用 ABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems,U.S.A.)测序,其中含 5 ×sequencing buffer 2.0 μL BigDye(3.1)0.5 μL,纯化模板 1.0 μL,1.3 引物 1.0 μL,纯净水5.5 μL。反应条件:预变性 96℃ 1 min。96℃30 sec,50℃ 5 sec,循环25次。60℃ 延长4 min。

1.6 序列分析

采用网页http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html和Genetyx-SV/RC version 11.0(Software Development Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)进行序列的比对和编辑。

2 结果

5种委陵菜trnL-F序列比较见图1。

图1 5种委陵菜trnL序列比较

3 讨论

除委陵菜外,其他种的trnL-F序列都是首次报道。如图1所示,委陵菜各种间trnL-F序列差异明显,故trnL-F序列分析及其衍生的方法可以用于鉴别委陵菜。委陵菜种类繁多,仅吉林省内就有十余种之多,所以本研究仅仅是一个开始,在今后的研究中需要扩大研究样本的种类,蓄积更多的资料,只有这样才能更准确地对委陵菜各种间进行鉴别。

[1]赵 川,乔 卫,张彦文,等.委陵菜抗糖尿病有效部位及有效成分的研究[J].中国中药杂志,2008,33(6):680-682.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2010版.北京:中国医药科技出版社,2010:199.

[3]杨 婷,孙海峰,曹思思,等.10种委陵菜生药学研究[J].时珍国医国药,2008,19(12):3039-3041.

[4]Taberlet P,Gielly L,Pautou G,et al.Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA[J].Plant Mol Biol,1991,17(5):1105-1109.

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