李春峰，鲁 静，唐进法

(1.郑州市第六人民医院，河南 郑州450015；2.河南中医学院第一附属医院，河南 郑州450000)

连翘是木犀科(Oleaceae)植物连翘(Forsythia suspensa)的干燥果实，性苦，味微寒，具有清热解毒、消肿散结之功效，用于痈疽、瘰疬，乳痈、丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛［1］。连翘中主要化学成分有木脂素类、黄酮和苯乙醇苷类萜类、挥发油等［2－3］。现代药理研究表明：连翘中含有的连翘酯苷A具有抗菌、抗病毒活性，芦丁具有抗氧化活性，两者是主要药效成分［4］。本文以芦丁和连翘酯苷A作为指标性成分，采用高效液相色谱法同时测定芦丁和连翘酯苷A的含量，为连翘药材的质控研究提供一套可靠的分析方法。

1 药品、试剂与仪器

连翘，购自河南省医药药材有限公司，产地为河南嵩县，经河南中医学院陈随清教授鉴定为正品，批号分别为121008，121009，121010。连翘酯苷 A，纯度大于98%，实验室自制；芦丁，中国食品药品检验所提供，批号20091021；甲醇为色谱纯；超纯水，由Milll-Q制备；其余试剂为分析纯。LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；KQ-300超声波提取器，河南中良科学仪器公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇 －2g/L 冰醋酸溶液(20∶80)，检测波长 329 nm，进样量 10 μL，体积流量1.0 mL/min，柱温30 ℃。

2.2 溶液的制备

按照参考文献［5］制备。

2.2.1 混合对照品溶液

分别称取芦丁、连翘酯苷A对照品适量，用500 g/L甲醇溶解，分别配制成浓度为21.1，15.3 mg/L的混合溶液，过 0.45 μm 有机微孔滤膜，即得。色谱图见图1(a)。

2.2.2 供试品溶液

取样品粉末(40目筛)约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入500 g/L甲醇50 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷，再称定质量，并用甲醇补足质量，摇匀，过滤，取滤液过 0.45 μm 的有机滤膜，即得。色谱图见图1(b)。

图1 对照品及供试品的HPLC色谱图

2.3 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液 1，2，5，10，15，20 μL，注入液相色谱仪，按色谱条件所述测定色谱峰峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标作线性回归，得到回归方程。芦丁：Y=590 210X －732.27，r=0.999 9。连翘酯苷 A：Y=653 574X+686.83，r=0.999 9。表明：芦丁在 0.021 1 ～0.422 0 μg，连翘酯苷 A 在0.015 3 ～0.306 0 μg 范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

准确吸取混合对照品溶液10 μL，按照色谱条件进行检测，重复测定5次，记录峰面积。结果：芦丁和连翘酯苷 A的 RSD分别为1.21%、1.16%。结果表明：仪器精密度良好。

2.5 重现性试验

精密称取同一批次的连翘样品粉末0.1 g，共5份，按照2.2项下供试品溶液的方法制备供试品溶液，按2.2项下检测方法分析，记录峰面积并计算含量，结果：芦丁和连翘酯苷 A的 RSD分别为1.52%、1.47%。结果表明：方法的重现性良好。

2.6 稳定性试验

精密称取连翘细粉0.1 g，按照上述方法制备供试品溶液，分别于室温下放置 0，2，4，6，8，12，24 h后进行检测。结果：芦丁和连翘酯苷A的RSD分别为1.35%、1.39%。结果表明：供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品粉末(批号为121009，芦丁含量为2.54 mg/g，连翘酯苷A含量为4.88 mg/g)0.1 g共6份，分别精密加入用500 g/L甲醇配制的芦丁质量分数为21.1 mg/L和连翘酯苷A质量分数为15.3 mg/L的混合对照品溶液20 mL，再精密加入500 g/L甲醇30 mL，其余按照供试品溶液制备方法项下方法操作，制备加样回收率供试品溶液，分别进样10 μL，根据测定的含量计算芦丁和连翘酯苷A的回收率。结果见表1。

表1 连翘中芦丁、连翘酯苷A加样回收率试验结果

2.8 样品分析测定

选择连翘样品3批，按照2.2方法项下制备供试品溶液，2.1项下方法测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果 n=3

3 小结

有关色谱条件的选择：利用PDA检测器在190～400 nm范围内不同检测波长下的色谱图，发现329 nm下基线平稳、干扰物质少，两成分具有较大吸收，因此选择329nm为测定波长。在试验中，选择了乙腈—水、甲醇—水及添加冰醋酸等不同流动相，乙腈、甲醇对分离没有太大影响，考虑乙腈毒性较大，选择甲醇作为有机相，水相中添加冰醋酸可以明显改善峰型和分离度，最终选择甲醇－冰醋酸溶液体系作为流动相。有关供试品溶液的制备：考察了甲醇、950 g/L乙醇、500 g/L甲醇对连翘中芦丁和连翘酯苷 A提取效率的影响，结果表明：500 g/L甲醇提取最好。以500 g/L甲醇做溶剂，比较超声和回流提取效果，超声提取效率更高，提取时间更短，故确定供试品溶液的制备方法为连翘药材用500 g/L甲醇超声提取30 min。本文采用高效液相色谱法同时测定连翘中芦丁和连翘酯苷A的含量，并测定了河南嵩县样品，该方法可靠稳定，重复性、稳定性好，适合于连翘的质量控制，为连翘药材的质量控制方法研究提供了参考。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：159－160.

［2］李倩，冯卫生.连翘的化学成分研究进展［J］.河南中医学院学报，2005，20(2)：78 －80.

［3］张海燕.连翘化学成分及药理活性的研究进展［J］.中药材，2001，23(10)：657 －60.

［4］臧志和，曹丽萍，钟铃.芦丁药理作用及制剂的研究进展［J］.医药导报，2007，26(7)： 758 －760.

［5］靖会，李教社，曹蔚，等.高效液相色谱法测定连翘中连翘酯苷的含量［J］.西北药学杂志，2003，18(4)：156 －157.