薛德林 吕盛福 胡江春 孙向阳 王书锦

(1 中国科学院沈阳应用生态研究所 沈阳 110016 2 大连翔华生物饲料有限公司 大连 116222)

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是能够产生芽孢的兼性好氧微生物。在分类学上属原核生物、真细菌[1]。主要分布在海洋、江河、湖泊、活性污泥和土壤中[2，3]。由于枯草芽孢杆菌具有生物好氧、调整菌群、抑制病菌、生物拮抗等功能，使其在提高动物机体免疫力、增强消化系统酶活性、防病治病和促进生长中起着重要作用[4]。枯草芽孢杆菌菌体繁殖速度快、容易培养，能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸，其芽孢抗逆性强、耐高温、耐酸碱、耐挤压，产品适用范围广泛等特点，并且它能作为模式菌株在生物芯片上进行有效的DNA扩增和蛋白质、氨基酸分离[5，6]。国内外许多学者研究表明，枯草芽孢杆菌在医药保健、水产养殖、禽畜养殖和生态环保等方面均有较高的研究价值和应用价值[7]。因此，枯草芽孢杆菌愈来愈引起科技工作者和企业界人士的重视[2，4，8～12]。

腐植酸钠是碱性的有机大分子聚合物，分子中含有苯环和吲哚等，功能基团有羟基、酚羟基、甲氧基等，在海参养殖中的应用主要是利用这些活性基团，吸附水域环境中的有毒有害物质，净化养殖环境。腐植酸钠作为营养物质，含有的蛋白质、氨基酸、有机钙、微量元素、抗病因子等生物活性物质，有利于营养物质的转化吸收和新陈代谢，可以减少肠道疾病的发生，近年来，在海参养殖中已有应用[3，10]。

现将枯草芽孢杆菌BS-2018菌株和腐植酸钠在海参育苗和养殖中的试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

枯草芽孢杆菌B S-2 0 1 8菌株，从东经122°21′，北纬39°34′的辽宁大连黄海海域的10 m深海底的底泥中分离得到。

1.1.1 培养基与培养条件

斜面种子培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化钠1 g、硫酸镁5 g、磷酸氢二钾1 g、纯净水定容至1000 mL、pH值7.0～7.2、琼脂20 g。

灭菌条件：0.08 MPa、115 ℃灭菌、18 min；培养温度：30 ℃，培养箱静止培养48 h。

液体种子培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、酵母粉5 g、玉米面10 g、豆粕10 g、硫酸铵1 g、氯化钠1 g、硫酸镁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、纯净水定容至1000 mL、pH值7.0～7.2。

500 mL三角瓶装液量为200 mL，接种量5%，灭菌条件：0.1 MPa、121 ℃灭菌、18 min；培养温度：30 ℃，转数180 rpm、摇床培养培养36 h。

1.1.2 发酵罐培养基与发酵培养条件

发酵罐培养基：葡萄糖1.0%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、玉米面1.0%、豆粕1.0%、硫酸铵0.1%、氯化钠0.1%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.10%、pH值7.0～7.2。

发酵罐装液量为70%，接种量5%，灭菌条件：0.08 MPa、121 ℃、20 min;

发酵罐培养条件：发酵时罐内压强0.03～0.05 MPa、培养温度30 ℃、转速180 rpm、无菌风量100～120 vvm、时间为48 h。

1.2 供试腐植酸钠

腐植酸钠含量≥55.0%，其他成分≥5.0%，新疆双龙腐植酸有限公司，市售。

1.3 供试海参

辽宁海刺参(Apostichopus Japonicus)，辽宁省大连渤海海珍品科技公司，自繁。

1.4 试验布置

1.4.1 海参浮游期、稚幼参期、越冬保苗期试验布置

试验养殖池布置：

试验组1、试验组2与对照组各设置3个养殖池，共设置9个试验池，每个养殖池水体体积为4.8 m×3.0 m×1.2 m＝17.28 m3，随机排列。

浮游期试验处理：

试验组1：饵料+10 mL/m3水体/d生物制剂(养殖池水中含活菌数浓度为≥2×105cfu/mL);试验组2：饵料+15 mL/m3水体/d生物制剂(养殖池水中含活菌数浓度为≥3×105cfu/mL)；

对照组：饵料。

试验期间饵料中不添加任何抗生素和其他添加剂。

试验养殖池布置同1.4.1。

稚幼参期、越冬保苗期试验布置：

试验组1：饵料中1%添加，并5 mL/m3水体/d泼洒生物制剂；

试验组2：饵料中2%添加，并10 mL/m3水体/d泼洒生物制剂；

对照组：饵料。

试验期间饵料中不添加任何抗生素和其他添加剂。

1.4.2 海参成参养殖期试验布置

成参试验养殖池布置：

试验组1、试验组2、对照组共设3个试验池，每个养殖池水体为100×667 m3，随机排列。

试验池1：5 g腐植酸钠和10 mL/m3水体/15 d泼洒生物制剂；

试验池2：10 g腐植酸钠和15 mL/m3水体/15 d泼洒生物制剂；

对照组：不作任何处理。

使用方法：按照潮汐规律，大潮后全池喷施，大换水等管理措施，按常规方式进行。

1.5 试验时间和试验地点

浮游期试验时间∶2012年6月3日～6月18日，试验期为15 d；

稚幼参期试验时间：2012年7月21日～8月5日，试验期为15 d；

越冬保苗期试验时间：2011年3月11日-～5月25日，试验期为15 d；

成参养殖期试验时间：2011年5月1日～11月15日。

试验地点：大连渤海湾海珍品科技开发公司种苗孵化场、外海海参圈内。

1.6 枯草芽孢杆菌和弧菌检测及观察

枯草芽孢杆菌培养：采用细菌培养基，平皿培养，稀释涂平板法计数；

弧菌培养：采用国标购买的TCBS培养基，平皿培养，稀释涂平板法计数；

海参幼体形态观察采用普通光学显微镜放大15×10倍观察；

海参幼体胃内微生物数量观察采用普通光学显微镜放大15×40倍观察；

每个试验处理观察幼体和微生物均为10个幼体，3次重复，取平均值计数。

2 结果与讨论

2.1 枯草芽孢杆菌BS-2018生物学特性

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，芽孢杆菌属，细胞呈直杆状，单个细胞0.7～0.8×2～3 μm，革兰氏阳性菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢大，椭圆形或柱状，0.6～0.9×1.0～1.5 μm，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。能够很好的利用淀粉、柠檬酸盐、丙酸盐。在厌氧条件下、氯化钠含量在10%以下均能生长。生长温度范围在30～55 ℃，最适温度35 ℃。pH值范围在5.6～8.8。菌落形态为污白色或微黄色不透明，表面粗糙，边缘无规则，不整齐。在液体培养时，常形成皱醭。

2.2 枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂的生产过程

试管斜面菌种→三角瓶液体种子→发酵罐液体种子培养→发酵罐液体发酵培养。发酵罐液体发酵培养结束后，用平皿培养法检测，含枯草芽孢杆菌芽孢≥200×108cfu/g合格产品，密闭条件下灌装，得到枯草芽孢杆菌芽孢生物制剂，入库备用。

2.3 枯草芽孢杆菌BS-2018在海参育苗浮游期的应用效果

枯草芽孢杆菌BS-2018(浓度为200×108cfu/mL)在海参育苗浮游期应用效果的试验见表1。

枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂日投量10～15 mL/m3水体，每天换水1/2水体，幼体吞噬正常，没有任何不良反应。用15×10倍显微镜观察试验组幼体，看到边缘整齐，清晰，幼体发育正常。用15×40倍显微镜观察试验组幼体胃的形状和活力，看到幼体胃形正常、饱满度好、摄食正常，变态整齐，胃中枯草芽孢杆菌等分布均匀，对照组幼体胃中，枯草芽孢杆菌和芽孢菌类明显少于试验组。从表1可以看出，枯草芽孢杆菌在水体中存活繁殖，能抑制弧菌增殖。幼体的烂边病、烂胃病的发病率明显降低，海参幼体成活率明显提高。

表1 枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂在海参浮游期的应用效果(20 ℃±1)Tab.1 Application effects ofBacillus subtilis BS-2018 as biological agent on the sea cucumber planktonic period (20 ℃ ±1)

2.4 枯草芽孢杆菌BS-2018在海参稚幼期的应用效果

枯草芽孢杆菌B S-2018(浓度为200×108cfu/mL)在海参稚幼期的应用效果试验见表2。

从表2数据可以看出，在海参稚幼期中，枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂，在饵料中1%添加和5 mL/m3水体泼洒，每天应用1次，可以使幼参增产18.14%；在饵料中2%添加和10 mL/m3水体泼洒，每天应用1次，可以使幼参增产15.25%。海参体重、体长明显增加。

2.5 枯草芽孢杆菌BS-2018在海参越冬保苗期的应用效果

枯草芽孢杆菌B S-2018(浓度为200×108cfu/mL)在海参越冬保苗期的应用效果试验见表3。

从表3可以看出，在海参越冬保苗中，枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂在饵料中1%添加和

5 mL/m3水体泼洒，每天应用1次，可以使幼参增产11.18%；在饵料中2%添加和10 mL/m3水体泼洒，每天应用1次，可以使幼参增产16.77%。海参体重、体长明显增加。

表2 枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂在海参稚幼期的应用效果Tab.2 Application effects ofBacillus subtilis BS-2018 as biological agent on the sea cucumber juveniles immature period

表3 枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂在海参越冬保苗期的应用效果Tab.3 Application effects ofBacillus subtilisBS-2018 as biological agent on the sea cucumber winter seedling period

2.6 枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂在海参成参养殖期的应用效果

枯草芽孢杆菌BS-2018(浓度为200×108cfu/mL)和腐植酸钠在海参成参养殖期的应用效果试验见表4。

从表4可以看出，在海参圈的成参养殖中，试验组1腐植酸钠5 g和枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂10 mL/m3水体泼洒，15 d应用1次，可以使成参增产11.32%；试验组2腐植酸钠10 g和枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂15 mL/m3水体泼洒，15 d应用1次，可以使成参增产17.82%。

在海参圈成参养殖中，15 d应用1次，腐植酸钠的应用量10 g/m3水体，枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂15 mL/m3为最佳。不但可以增产，还可以有效地减少由于弧菌引起的海参圈海参周身腐烂病等病害，还有调控水质，净化水域环境作用。

表4 枯草芽孢杆菌BS-2018生物制剂在海参成参养殖期的应用效果Tab.4 Application effects ofBacillus subtilis BS-2018 as biological agent on the sea cucumber parameters breeding period

3 结论

(1) 枯草芽孢杆菌BS-2018在海参育苗浮游期(10～15 mL/m3水体/d泼洒)应用，可使海参幼体成活率分别提高到22.3%、35.3%，发病率分别降低到18.0%、26.0%。在海参稚幼期(饵料中1～2%添加和5～10 mL/m3水体/d泼洒)应用，可使海参稚幼参增产15.25%～18.14%。在海参越冬苗保苗期(饵料中1～2%添加和5～10 mL/m3水体/d泼洒)应用，可使海参稚幼参增产11.18%～16.77%。

(2) 腐植酸钠和枯草芽孢杆菌生物制剂，在海参圈中的成参养殖中应用，按照潮汐规律，大潮换水后(15 d 1次)应用，用量为腐植酸钠5～10 g/m3水体和枯草芽孢杆菌10～15 mL/m3水体，方法为全池泼洒，可使成参增产11.32%～17.82%，并可以有效地减少由于弧菌引起的海参圈海参周身腐烂病等病害。还有调控水质，净化水域环境作用。腐植酸钠和枯草芽孢杆菌生物制剂在海参成参养殖应用，没有任何毒副作用和不良反应。

(3) 枯草芽孢杆菌和腐植酸钠作为生态型微生物制剂和营养型生物饵料，在海参养殖中应用，有利于海参营养物质的转化吸收和新陈代谢，可以减少肠道疾病的发生，明显提高海参产量。枯草芽孢杆菌和腐植酸钠微生态制剂在海参养殖中的应用，将会取得良好的经济效益、社会效益和生态效益，具有广阔的前景。

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