田秀丽，齐 峰(.承德医学院，河北承德 067000;2.保定市第一中医院)

结肠癌被发现时大多处于中晚期，死亡率仅次于肺癌和肝癌，居恶性肿瘤死亡榜的第三位，其中80%以上为散发性结肠癌(SCC)[1]。研究发现，结肠癌发生发展的途径主要有染色体不稳定(CIN)途径(以癌基因和抑癌基因为主)和微卫星不稳定(MSI)途径(以错配修复基因(MMR)为主)[2]。MMR是DNA修复系统的重要成员，已证实MMR的改变与多种恶性肿瘤尤其是结直肠癌的发病密切相关，并且与约15%的散发性结直肠癌有关[3-4]。本研究分别选取代表MSI途径的hMSH6基因和代表CIN途径的p53基因，采用免疫组化法检测二者在SCC中的表达情况，探讨hMSH6和P53蛋白在SCC发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料 保定市第一中心医院病理科2010年-2012年经手术切除的结肠癌患者的存档蜡块60例，以距肿瘤边缘＞5.0cm的正常癌旁组织60例作为对照，所有病例均经病理明确诊断。所有结肠癌患者临床资料完整，术前未接受放疗和化疗，TNM分期为Ⅰ-Ⅳ期。除外家族性多发性腺癌(FAP)患者和HNPCC患者。

1.2 方法与试剂 石蜡包埋的组织4μm连续切片，采用免疫组化Envision二步法检测hMSH6和P53蛋白的表达，一抗(购自福州迈新生物技术开发有限公司，工作浓度1:100)4℃孵育过夜，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性反应。

1.3 结果判定 每张切片计数5个高倍视野(10×40)，每个视野计数100个细胞。根据Fromowitz等[5]的方法判定结果:①不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;②着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%-20%为1分，21%-50%为2分，≥51%为3分。以染色程度与染色细胞百分率得分乘积为最后得分:0-1分为阴性，2分以上为阳性。

1.4 统计分析 采用SPSS 17.0统计软件处理数据，计数资料行卡方检验，相关分析采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 SCC和癌旁正常组织hMSH6和P53蛋白的表达情况 hMSH6和P53蛋白阳性产物位于细胞核。SCC中hMSH6的阳性表达率明显低于癌旁组织，P53的阳性表达率明显高于癌旁组织，差异均具有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)。见表1。

表1 SCC和癌旁组织hMSH6和 P53蛋白的表达情况[n(%)]

2.2 hMSH6和 P53表达与SCC临床病理特征的关系SCC中hMSH6蛋白的表达与肿瘤浸润深度和发生部位有关(P＜0.05);与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学分级、有无淋巴结转移无关(P＞0.05)。SCC中P53蛋白的表达与以上临床病理特征均无关(P＞0.05)。见表2。

表2 hMSH6和P53表达与SCC临床病理特征的关系(n=60)

2.3 SCC中hMSH6与P53表达的相关性 SCC中hMSH与P53的表达呈负相关(P＜0.05)。见表3。

表3 SCC 中hMSH6与P53表达的相关性

3 讨论

MMR是近年来在研究HNPCC时分离出来的一组遗传易感基因，是一种能修复细胞中DNA碱基错配的安全保障体系。MMR系统失活导致肿瘤发生的途径主要是引起微卫星不稳定(MSI)以及MMR系统失活直接导致癌基因激活或抑癌基因失活，从而诱发癌变[6]。

hMSH6作为MMR家族的重要成员，在结肠癌的发生发展中具有重要作用。hMSH6亦称为G/T错配结合蛋白(GTBP)，1995年发现hMSH6参与构成错配结合因子，1997年首次报道了人类hMSH6基因突变，其突变时癌基因和抑癌基因的突变率增加，进而引起遗传不稳定复制错误增加和MSI，使细胞的肿瘤易感性增加[7]。本研究发现，60例SCC中hMSH6蛋白阳性表达率为76.7%与林武华等[8]的研究结果一致，表明SCC中确实存在hMSH6的低表达。本研究还发现，SCC中hMSH6阳性表达与肿瘤浸润深度和发生部位有关，因此，对高危人群进行hMSH6筛查，可为结肠癌的发生和转归提供依据。

p53基因分为野生型和突变型两种，野生型p53为抑癌基因，它在细胞中含量很少且半衰期短，免疫组化法很难检出;突变型p53是一种癌基因，能促进细胞的恶性转化，在细胞中其蛋白的表达量较高且半衰期延长，通过免疫组化法检测到的P53蛋白基本上是突变型P53蛋白[9]本研究发现，60例SCC中，突变型P53蛋白的阳性表达率为55%，明显高于癌旁正常组织，说明突变型p53基因与结肠癌的发生关系密切;但本研究未发现突变型p53基因与SCC的临床病理特征有关。

但一个癌基因的激活不足以引起细胞的恶性转化，本研究中SCC组织hMSH6蛋白与突变型P53蛋白的表达呈负相关，表明SCC中hMSH6蛋白的低表达可能是p53蛋白高表达的原因之一，二者共同作用导致了SCC的发生发展。hMSH6蛋白低表达和突变型P53蛋白高表达可能是结肠癌发生的危险因素，二者与SCC发生的确切关系还有待进一步的研究。

[1]de la Chapelle A. Genetic predisposition to colorectal cancer[J].Nat Rev Cancer, 2004, 4(10):769-780.

[2]Esteller M, Levine R, Baylin SB, et al. MLH1 promoter hypermethylation associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas[J]. Oncoqene,1998, 17(18):2413-2417.

[3]Knudson AG. Hereditary predisposition to cancer[J]. Ann N Y Acad Sci, 1997, 833:58-67.

[4]Walther A, Houlston R, Tomlinson I. Association between chromosomal instability and prognosis in colorectal cancer: a meta-analysis[J]. Gut, 2008, 57(7):941-950.

[5]Fromowitz FB, Viola MV, Chao S, et al. ras p21 expression in the progression of breast cancer [J].Hum Pathol, 1987,18(12):1268-1275.

[6]Kang Y, Zhang Z, Wang J, et a1. Expression of hMSH2 gene and mutant p53 in sporadic digestive tract tumors [J]. Chin Med J(Engl), 2003, 116(1):53-56.

[7]Fong K, Zimmerman P. Microsatellite instability and other molecular abnormalities in non-small cell lung cancer [J].Cancer Res, 1995, 55(1): 28-30.

[8]林武华，孙念绪，张青平.散发性结直肠癌微卫星不稳定性与hMSH3和hMSH6基因突变的研究[J].武警医学，2001，12(7):392-395.

[9]Villunger A, Michalak EM, Coultas L, et al. p53- and druginduced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa [J]. Science, 2003, 302(5647):1036-1038.