王 昊 柴 晔 陈慧玲 李志虎 张连生

兰州大学第二医院血液科，甘肃兰州 730000

非霍奇金淋巴瘤作为一种恶性肿瘤日益危害着人类的健康，如何治疗和提高治疗效果成为临床医务工作者的研究关键。大量的临床和临床前期研究表明顺铂 （cisplatinum-diamino-dichloride，DDP）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）具有显著的抗肿瘤作用[1-2]，且治疗非霍奇金淋巴瘤具有良好效果[3]。DDP预处理可以增强CIK细胞对部分癌细胞的杀伤作用[4-6]。本文研究目的主要是通过细胞体外培养的方法研究经顺铂预处理后，是否可以增强CIK细胞杀伤淋巴瘤细胞的杀伤活性，为临床应用化疗联合CIK细胞治疗非霍奇金淋巴瘤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DDP购自齐鲁制药（海南）有限公司（批号:A1A1212052）；重组人白介素-2（IL-2）购自山东泉港药业有限公司（批号:201207003）；γ 干扰素（IFN-γ）购自上海凯茂生物有限公司（批号:20121110）；抗CD3单克隆抗体购自Bioscience公司（批号:E06304-1633）；CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit（C34554）购自 Invitrogen 公司（批号:1255942）；碘化丙啶 （PI）购自碧云天生物技术研究所 （编号ST511）；RPMI1640购自GIBCO公司（批号:1161726）；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司（批号:121122）；淋巴细胞分离液购自MP公司（批号:V0711A）；流式细胞仪为美国BD产品。

1.2 实验细胞

人类非霍奇金淋巴瘤细胞株Namalwa（Burkitt淋巴瘤细胞株）、SU-DHL-4（弥漫大B淋巴瘤细胞株）均购自上海交通大学医学院附属仁济医院白血病研究室。实验细胞株于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 CIK细胞体外培养

抽取健康人外周血50 mL，使用密度梯度离心方法分离外周血取得单个核细胞，把细胞浓度调整为1×106/mL进行后续培养，第1天加入IFN-γ 1000 U/mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养24 h，然后分别加入重组人白介素-1（IL-1）100 U/mL、重组人 IL-2（IL-2）500 U/mL、抗CD3单克隆抗体50 ng/mL，在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养。以后每3天半量更换新鲜培养液，并补加重组人IL-2，细胞密度调整至1×106/mL，培养期间用流式细胞仪监测细胞免疫表型变化。

1.4 四种DDP浓度预处理后CIK杀伤效果影响

分别向Namalwa细胞、SU-DHL-4细胞中加入浓度为0、25、50、75 μg/L 的 DDP 培养 18 h，再加入 CIK 细胞，CIK细胞与淋巴瘤细胞的效靶比为20∶1，用CFSE/PI双标法测CIK细胞对靶细胞的杀伤作用。

1.5 三种DDP时间预处理后CIK杀伤效果

分别向Namalwa细胞、SU-DHL-4细胞中加入浓度为25 μg/L 的 DDP，再分别培养 18、24、36 h 后，加入 CIK 细胞，CIK细胞与淋巴瘤细胞的效靶比为20∶1，用CFSE/PI双标法测CIK细胞对靶细胞的杀伤作用。

1.6 流式细胞仪监测CIK细胞免疫表型变化并检测CIK细胞对靶细胞的杀伤效果

CIK培养期间用流式细胞仪监测细胞免疫表型变化。细胞样本采用CFSE/PI双标法进行检测。分别收集处理后的细胞样本上流式细胞仪进行检测，取30000～50000个细胞进行分析。CFSE的荧光强度在流式检测时是用FL1荧光通道检测，PI的荧光强度则是通过FL2荧光通道检测。CFSE，PI双阳性的细胞为被杀伤的靶细胞，除以靶细胞总分数，即为杀伤率。实验重复4次，取4次实验平均值进行分析。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIK细胞的培养

细胞换液时进行无菌检测（细菌、真菌、支原体、病毒等），并取少量CIK细胞培养物加入相应检测抗体混匀，避光放置25 min后，上流式细胞仪进行检测，结果显示CIK细胞在培养 21 d 左右时，CD3+、CD56+和 CD3+CD8+的细胞比例均较理想，细胞活性可保持96%以上，可持续至25 d左右，所以本实验选择培养21 d时的CIK细胞进行实验，见图1。

图1 杀伤细胞的免疫表型

2.2 四种DDP浓度预处理后CIK杀伤效果影响

细胞生长达70%融合时，分别向Namalwa细胞、SU-DHL-4细胞中加入浓度为 0、25、50、75 μg/L 的 DDP 培养 18 h，Namalwa 细胞死亡率为 0、（2.70±0.35）%、（7.03±1.40）%、（8.450±0.93）% ，SU-DHL-4 细 胞 死 亡 率 为 0、 （2.30±0.60）%、（5.03±0.84）%、（8.15±0.88）%。加入 CIK 细胞（与淋巴瘤细胞的效靶比为20∶1），CIK联合四种浓度的DDP杀伤 Namalwa 细 胞的 杀伤 率为 （14.18±2.38）%、（30.73±2.63）%、（43.78±2.52）%、（51.53±1.98）%，杀伤 SU-DHL-4细胞的 杀伤 率为 （13.00±3.34）%、（29.00±2.28）%、（41.75±2.62）%、（50.03±0.90）%（图 2）。结果显示，DDP 预处理浓度增加，CIK杀伤靶细胞效应增强。

图2 不同浓度顺铂预处理，杀伤细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用

2.3 三种DDP时间预处理后CIK杀伤效果影响

在两种淋巴瘤细胞中分别加入25 μg/L的DDP分别培养 18、24、36 h，DDP 对 Namalwa细胞杀伤率分别为（2.70±0.35）%、（4.47±1.02）%、（5.83±0.78）%，DDP 对 SUDHL-4细胞的杀伤率分别为（2.30±0.60）%、（3.50±1.17）%、（5.43±0.66）%。加入 CIK 细胞（与淋巴瘤细胞的效靶比为20∶1），在不同时间点，DDP联合CIK对Namalwa细胞的杀伤效应为 （30.73±2.63）%、（40.75±2.33）%、（46.70±3.74）%，对 SU-DHL-4 细胞的杀伤效应为（29.00±2.28）%、（39.35±1.79）%、（42.40±3.04）%。结果显示，DDP 作用靶细胞24 h后，有显著的靶细胞死亡。随着DDP预处理时间延长，再联合CIK细胞，靶细胞的死亡率增加（图3）。

图3 不同时间DDP预处理，CIK对淋巴瘤细胞的杀伤作用

3 讨论

DDP被广泛应用于临床，但需很高剂量，顺铂的药理作用才能发挥，治疗过程中会出现许多不良反应，例如恶心、呕吐、食欲减退、肾及泌尿系损害等[7]。怎样使化疗增效，成为研究者的难题。1991年，一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞由斯坦福大学的Schmidt等[8]首先报道。长期大量研究表明CIK细胞具有可大量增殖、对多种肿瘤细胞杀伤活性强大、非MHC限制性、对自身组织无细胞毒作用等优点[9-10]。CIK为多种细胞混合体，其杀伤机制为，CIK细胞在受到刺激时，会释放以CD3+CD56+双阳性细胞为最大颗粒释放量的具有细胞毒性的胞质颗粒物，作为外源性局部定向的细胞溶解毒素，通过细胞膜渗透，直接杀伤肿瘤细胞。CIK细胞活化后产生大量炎症细胞因子，如TNF-α、IL-2、GM-CSF等，既可直接抑制肿瘤细胞，又可通过调节机体免疫系统反应，间接杀伤肿瘤细胞。许多肿瘤细胞表达FasL，诱导免疫效应细胞凋亡，使免疫治疗成功性减低。体外培养过程中，CIK细胞表达FasL，可以通过对FasL阳性肿瘤细胞的诱导凋亡，长期慢性杀伤肿瘤细胞，也对FasL阳性肿瘤所致的凋亡有对抗作用[11-13]。

近年来，已有化疗联合CIK细胞协同治疗肿瘤的相关报道，可提高肺癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤等的治疗效果[4-5，14]。本实验研究经顺铂预处理后对CIK细胞杀伤非霍奇金淋巴瘤细胞的影响。实验选取人类NHL细胞Namalwa细胞、SU-DHL-4细胞，经不同DDP浓度及时间预处理后，发现CIK杀伤靶细胞效应随DDP浓度增加、时间延长均增强。实验显示低浓度、短时间DDP对靶细胞的杀伤效果欠佳，但联合CIK后可使靶细胞明显死亡。据文献报道，其增效作用可能依赖于机体T淋巴细胞。内源性T淋巴细胞群包含两部分，即肿瘤抑制性及促进性亚群。肿瘤抑制性T淋巴细胞亚群可与CIK细胞共同抑制肿瘤细胞生长。DDP预处理后，可促进发生免疫调节性肿瘤抑制作用，并可增强CIK免疫治疗疗效。Treg为重要肿瘤促进性T淋巴细胞亚群细胞，DDP预处理后，肿瘤微环境中的比例下降，促进免疫应答发生，抑制肿瘤生长[15]。

综上所述，与单用CIK细胞治疗相比，DDP预处理后联合CIK对淋巴瘤细胞更具杀伤作用，可大幅提高肿瘤细胞的杀伤率。本实验可进行进一步研究，更好地为化疗联合免疫治疗的临床应用提供依据。

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