袁明杰 孔 彬 权 力 胡红耀 王少波 唐艳红

武汉大学人民医院心血管内科，湖北武汉 430060

心肌梗死（MI）后心室主要重构过程包含心室扩张、纤维化，最终导致心功能异常。有疗效的诱导血管再生对于MI后的慢性心肌缺血和相关的重塑是一种很有前景的治疗方法[1]。血管内皮生长因子（VEGF）是血管生成的一个重要引发剂[2]。Ghrelin是从人类和大鼠胃里分离出的一个28-氨基酸多肽，并在1999年认定为一个GHS-R1A型的内源性配体，这已被证明作用在心脏和血管里[3-4]。人工培养的心肌细胞能够合成Ghrelin。Ghrelin除对心血管系统有保护作用外，Ghrelin及其受体在人类微血管内皮细胞（HMVEC）中有表达，并且Ghrelin通过ERK2信号的激活，刺激HMVEC的增殖、迁移和血管生成[5]。另外，Ghrelin表达量的减少是血管生成后老化相关损害的影响因素之一[6]。目前，Ghrelin是否能促进心肌梗死后的活体动物模型心肌血管生成及其可能的机制仍未明确。因此，本研究旨在通过建立心肌梗死大鼠模型，研究Ghrelin对心肌血管在成的影响，并试图阐明其相关的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

Ghrelin购自美国Alexis公司；日本Bioer定量PCR检测系统；S-P免疫组化染色试剂盒购自于深圳晶美生物科技公司；DBA显示试剂盒购自于深圳晶美生物科技公司；抗兔多克隆抗体及化学发光工具包购自于碧云天生物技术研究所；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）购自于武汉博士德公司。

1.2 动物模型制作及分组

清洁级健康雄性SD大鼠，10周龄，体重为200～250 g购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔给药麻醉动物后气管插管，连接小动物呼吸机，然后暴露心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间结扎冠脉前降支制成心肌梗死（MI）模型。纳入实验的雄性SD大鼠65只，随机分为假手术组（15只），心肌梗死盐水组（25 只），心肌梗死 Ghrelin 组（25 只）。

1.3 药物干预

在MI模型成功建立后第7天，开始药物干预。心肌梗死Ghrelin组大鼠按100 μg/kg皮下注射大鼠Ghrelin，每天两次，假手术组及心肌梗死盐水组在相应部位注射生理盐水，给药时间为4周。

1.4 实时定量PCR（RT-PCR）方法检测VEGF mRNA表达

取梗死边缘区左室心肌组织100～150 g，加入l mL Trizol，冰上匀浆，提取总RNA，并合成cDNA。所有引物均参照GenBank提供的序列，用Primer 5.0设计，由上海生物工程公司合成。引物序列如下:VEGF（15 bp）:上游5′-GGGATGATGACGACCTGC-3′，下游 5′CCACTTGTTGGCTTATGTT-3′；GAPD （10 bp）:上游 5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游 5′-TTGCGTTTCCAAAGTAAGTG-3′；反应条件:第1次循环94℃预变性 1 min，其后以94℃变性1 min；56℃退火 15 s，72℃延伸 5s，循环 50 次，最后 72℃5 min终止。反应完成后计算机自动分析Ct值。Ct值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数。根据溶解曲线和产物电泳结果判断反应产物特异性。

1.5 Western Blot方法分析检测VEGF蛋白表达

取梗死边缘区心肌组织，按照蛋白抽提试剂盒说明书分离提取胞浆蛋白。利用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。置于5%脱脂奶粉中室温封闭l h，加入1∶500稀释的一抗（VEGF多克隆抗体）和1∶2000的磷酸甘油醛脱氢酶抗体，4℃孵育过夜。T-TBS洗涤3次后加入l∶1500稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗（抗兔IgG）中室温下孵育1h，然后T-TBS洗膜3次。将膜与增强化学发光（ECL）反应1～5 min后，曝光于X光胶片上，显影、定影。GAPDH作为上样内参，目的条带积分光密度值（OD）与上样内参积分OD比较，得出的相对OD值为VEGF蛋白表达水平。实验重复3次，取其平均值为最终结果。

1.6 免疫组织化学法分析新生血管的密度

取梗死边缘区和非梗死左室心肌组织100～150 mg，免疫组化分析切片组织具体同文献[7]。小动脉被定义为圆形的，α-SMA 阳性血管直径>10 μm，直径>20 μm 为大动脉。通过免疫组化图像分析系统测量光学密度，分析血管密度。

1.7 统计学方法

应用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示（±s），多组间比较用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以Kaplan-Meier曲线分析生存率。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物存活情况

24 h内死亡情况比较:心肌梗死盐水组与心肌梗死Ghrelin组死亡率分别为18.0%和16.0%（P>0.05）。术后存活24 h的45只动物进行Kaplan-Meier生存分析显示，心肌梗死盐水组和心肌梗死Ghrelin组28 d生存率比较，差异无统计学意义（66.1%比81.2%，P>0.05）。对死亡动物解剖分析未见到左室破裂，死亡原因多为急性充血性心力衰竭或心律失常。

2.2 Ghrelin对VEGF表达的影响

为了阐明血管生成的机制，在MI后的28 d，收集边界区的心肌组织进行实时定量PCR方法和Western blot分析方法对VEGF mRNA和VEGF蛋白含量进行测定。与假手术组相比，心肌梗死盐水组VEGF mRNA表达水平显著降低；与心肌梗死盐水组相比，心肌梗死Ghrelin组能显著提高MI大鼠降低的 VEGF mRNA表达量 （0.65±0.05比0.35±0.03，P<0.05）；心肌梗死 Ghrelin 组的 VEGF 蛋白表达水平显著提高（0.75±0.04 比 0.50±0.03，P<0.05）。Ghrelin促进血管生成可能是由于增加了局部VEGF的表达。见图1。

2.3 Ghrelin对梗死区和梗死周围血管密度的影响

与心肌梗死盐水组相比，心肌梗死Ghrelin组血管α-SMA 在心肌梗死部位密度较高 [（6±2.1）/mm2比 （4±1.8）/mm2（P<0.05）]，在梗死边缘区密度较高[（25±9.5）/mm2比（15±5.7）/mm2，（P<0.05）]。因此认为 Ghrelin 可有效的诱导缺血心肌的血管生成。见图2。

3 讨论

本研究利用MI动物模型证实了通过Ghrelin治疗能够诱导缺血心肌血管生成。Ghrelin对于MI后的血管重建的积极作用在于增加心肌VEGF的表达。

图1 各组大鼠VEGF mRNA和蛋白表达的定量比较

图2 心肌梗死盐水组与心肌梗死Ghrelin组在梗死区与梗死周围血管密度的比较

新生血管形成是梗死愈合过程的一个主要组成部分，特别是在梗死后早期，以及在后期的重塑阶段[8]。新生血管有利于建立侧支循环并减缓后期重塑的进展。VEGF是一个同型二聚体，在血管新生、动脉粥样硬化和损伤后应答的血管重塑中起着重要的作用[2，9]。基础和临床研究资料表明，VEGF能诱导缺血心肌的血管新生，改善心肌梗死心脏的功能[10-11]。过度表达的VEGF通过促进血管生成和抗凋亡作用改善心功能[8]。在愈合期增加的VEGF表达可促进伤口新生血管的形成[10]。在本模型中，笔者发现Ghrelin进一步增加心肌梗死后28 d动物的α-SMA阳性血管密度。Ghrelin增加心肌边界区域VEGF mRNA和蛋白表达水平，这表明Ghrelin使梗死心肌的新生血管增多可能是通过VEGF水平增加所介导的。Ghrelin使新生血管的增加可能改善心功能障碍和防止心脏重塑。

Ghrelin发挥上述积极作用可能存在如下机制:①PI3激酶/Akt信号通路在诱导MI后的心肌血管再生中有潜在的作用[12]。已有报道，胰岛素调控心肌VEGF的基因表达和血管生成，特别是通过胰岛素受体和激活PI3K/Akt通路[4，13]。②ERK1/2 MAP激酶途径也是通过抑制细胞凋亡调节血管生成的一个关键的级联反应[5，14]，Ghrelin通过激活ERK2信号刺激HMVEC增殖、迁移和血管生成[15]。③Ghrelin使体外培养的内皮细胞 （ECs）和完整的血管内的一氧化氮（NO）合酶（eNOS）激活[16-17]。④体内 Ghrelin干预可能会加大心脏原始干细胞增殖或补充外周血干细胞到梗死的心肌以促进血管形成[18]。综上提示，Ghrelin可能通过不同的信号通路介导血管生成。

综上所述，本研究显示Ghrelin能增加MI后心肌VEGF的表达，从而促进血管生成。Ghrelin治疗可望成为抑制心肌梗死后左室重塑的一种新对策。同时，Ghrelin对血管生成的作用更为详细的信号通路和分子机制仍需要进一步研究。

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