改进铁盐催化比色法测定保健食品中原花青素

2013-09-17杜利君姚亚婷王静慧刘晓琳吴雅欣

质量安全与检验检测 2013年5期

杜利君姚亚婷王静慧刘晓琳吴雅欣

(山西出入境检验检疫局山西太原 030024)

1 前言

原花青素(procyanidins)，是一类由不同数量的单体黄烷-3-醇缩合而成的聚多酚类物质，为植物多酚天然抗氧化剂，由于在酸性介质中加热可产生相应的花青素，因此称为原花青素。最简单的原花青素是儿茶素、表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体。此外，还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小，通常将二一四聚体称为低聚体(Procyanidolic Oligomers，简称OPC)，将五聚体以上的称为高聚体(Procyanidolic Polymers，简称PPC)[1]。其广泛存在于各种水果如葡萄、苹果和山楂的皮、核、梗以及黑荆树、马尾松、思茅松和落叶松等植物中。研究表明[2]，原花青素是一种强抗氧化剂和强自由基清除剂，在人体内的抗氧化和清除自由基[3]的能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍[4],具有保护心血管、预防高血压、抗肿瘤[5]、抗辐射、抗疲劳、抗突变及美容等作用,并且能够增强视力、提高夜视能力、消除眼睛疲劳,是一种应用前景十分广阔的植物功能成分。因而在医药、保健和食品等领域具有广泛的用途。因此对于原花青素含量的检测是目前面临的一个难题。

目前对于原花青素的检测的常用方法有可见分光光度法、高效液相色谱法[6]、电化学法[7]、流动注射化学发光法[8]、原子吸收法[9]、紫外分光光度法[10]、毛细管电泳法[11]、液相色谱质谱联用法[12]。目前应用最普遍的是可见分光光度法，它又分为香草醛一盐酸法[13]、正丁醇-盐酸法[14]、铁盐催化比色法[15]、KMnO4法[16]。铁盐催化比色法规定为保健食品中原花青素的检测方法，但此方法样品处理过程需要沸水浴回流40min，操作复杂，而且平行性不易控制。本研究基于此方法，对沸水浴回流步骤进行了改进，采用在顶空瓶中密封加热反应，极大地简化了样品前处理过程，同时避免了回流控制不当时，溶液损失以及空气中氧气对花青素造成破坏的问题，提高了测定的准确度和分析速度。已成功用于保健品中原花青素含量的准确测定。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

紫外可见分光光度计：德国耶拿公司；电子天平：瑞士梅特勒托利多仪器有限公司；烘箱：上海齐欣科学仪器有限公司；20mL顶空瓶。

2.1.2 试剂

正丁醇、盐酸、硫酸铁铵：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；甲醇：色谱纯，博纳艾杰尔科技；原花青素标准品。

硫酸铁铵NH4Fe(S04)2•12H20溶液：用浓度为2mol/L盐酸配成2%(m/v)的溶液；正丁醇盐酸溶液：将正丁醇与盐酸按95：5的体积比混合。

2.2 方法

2.2.1 标准溶液配制

称取原花青素标准品10mg，甲醇溶解定容至10mL。此溶液浓度为1mg/mL。精密吸取0、0.1、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配成浓度为0、10、25、50、100、150、200μg/mL的标准工作溶液，按2.2.3测定。

2.2.2 样品提取

粉状试样称取50mg试样置于100m L容量瓶中，加入30 mL甲醇，超声处理20 min，放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，离心或放置至澄清后取上清液待测。

2.2.3 测定

取6 mL正丁醇盐酸溶液置于20mL顶空瓶中，再加入0.2 mL硫酸铁铵溶液和1 mL待测溶液，加盖密封，混匀，置100℃烘箱中，加热40min，然后立即置冰水中冷却，在加热完毕15 min后，于546 nm波长处测吸光度，由标准曲线计算试样中原花青素的含量。显色在1h内稳定。

3 结果与讨论

3.1 测定原理

原花青素在酸性条件下加热可发生一种氧化还原反应，转变为红色的花青素，而花青素与硫酸铁铵反应可生成较深颜色的化合物，该化合物在550mm处有最大吸收峰，而Fe3+在整个反应体系中则起到一个催化的作用，且其含量达到一定水平时，反应才能够完全，比色测定其吸光值与原花青素标准品对照便可定量计算样品中原花青素含量。

3.2 方法的改进

原方法为取出6mL正丁醇盐酸溶液置于具塞锥瓶中，再加入0.2mL 硫酸铁铵溶液和1mL试样溶液，混匀，置沸水浴回流，加热40 min后，测定。所采用的是沸水浴回流来使花青素与硫酸铁铵反应，在实际操作过程中做大量样品检测时，沸水浴回流步骤复杂，对仪器和人员要求较高，回流过程控制不当，容易使溶液挥发导致平行性差，而且整个回流过程中空气中的氧气影响花青素的反应，从而稳定性也差，要想取得一个好的检测结果，对人员、设施的要求较高。

本方法针对此问题进行了研究改进，将沸水浴回流改为了顶空瓶密封后在100℃烘箱中保温40 min，大大减化了操作步骤，提高了大批量检测任务的工作效率，同时反应过程隔绝了空气，结果稳定可靠。

3.3 检测波长的确定

原花青素标准溶液按2.2.3显色后，在400-1000可见光波长范围内进行扫描，测定光谱扫描图见图1，结果标明，在546nm处有最大吸收。

图1 原花青素光谱扫描曲线

3.3 线性范围

分别配成浓度为0、10、25、50、100、150、200 μg/mL的原花青素标准溶液，显色后测定其吸光度，以“吸光度”为横坐标，以“待测液中原花青素含量”为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.0506+0.0033*X，相关系数r为0.997。表明原花青素含量在0-200μg/mL范围内有良好的线性关系。