曹 军 于伯华 沈山江 秦志军

（盐城出入境检验检疫局 江苏盐城 224002）

1 前言

砷(As)是很早就被人类所熟知的金属元素，在环境中普遍存在。砷及其化合物在农业上常用作杀虫、毒鼠和灭钉螺；工业生产中用于毛皮的消毒、 防腐、脱毛；玻璃工业中用作脱色剂，同时一些砷化物具有药用作用。随着工业化程度的日趋加快，砷的污染日益加剧，对人类的威胁日趋严重。其污染主要来自饮用水、食物中的农药兽药残留和燃烧高砷煤等。砷的中毒机理主要被认为是其封锁了蛋白质的氢硫基，或置换了酶活性中心的铜或锌[1]，砷中毒可引起所谓的黑脚病，严重的可以导致癌症。

元素的毒性大小不仅与其总量有关，重要的是与元素存在的化学形态密切相关。As以多种形态存在，包括高毒性的As(III)、As(V)，低毒性的MMA(一甲基砷)、DMA(二甲基砷)和基本无毒的TMA(三甲基砷)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)和AsS(砷糖)。研究表明无机砷化合物的毒性远远大于甲基砷化合物，而一般认为砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)和砷糖无毒[2]。

我国食品卫生标准中规定了相关食品的总砷含量，并制定了配套的检测方法；同时制定了贝类、虾蟹类及其他水产品(鲜重)中无机砷的限量:≤0.50mg/kg(GB2733-2005)，贝类、虾蟹类及其他水产品(干重)中无机砷的限量：0.10mg/kg(GB10144-2005)。 其配套的无机砷检测方法采用6mol/L盐酸溶液提取样品中无机砷，采用原子荧光法测定，但对某些样品的测定产生假阳性的结果。进一步研究表明，海产品中含有大量的无毒砷甜菜碱、砷糖，在酸性条件下提取可能发生分解，转化为无机砷检出。因此通过测定海产品中总砷或采用酸提法测定无机砷已不能准确反映此类食品中砷的污染状况，必须进行砷形态分析，为保障食品安全提供有效数据。

目前用于形态砷分析的技术主要采用联用技术，其中高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱法(HGAFS)，因其成本低，分析灵敏度高，目前已成为一种有效的联用检测方法，用于检测不同形态砷含量。由于各类食品的基质差异大，样品提取的条件不同，本文针对水产品和环境介质底泥，采用液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法连用技术建立相应的形态砷分析方法。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

SA-10原子荧光形态分析仪：北京吉天仪器有限公司。涡旋仪：IKAMS-MiniShaker；超声波清洗仪：上海科导SK 3300LHC；低速离心机：飞鸽TDL-40B；水浴振荡器：上海跃进SHZ-A；p H计：梅特勒DELTA320；搅拌碎肉机。

2.1.2 试剂

砷标准品：德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇：均为色谱级，美国Fisher Scientific公司；磷酸氢二铵、盐酸、硼氢化钾、双氧水均为优级纯；水为去离子水。

2.2 方法

2.2.1 标准溶液的配制

分别准确称取0.01g（精确至0.0001g）五价砷、一甲基砷、二甲基砷、三价砷标准品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，配制成浓度为100mg/L的标准贮备液，于-4℃保存。按照需要吸取相应标准储备液，用流动相逐级稀释成含三价砷、一甲基砷、二甲基砷、五价砷的浓度为20、40、60、80、100g/L的标准工作溶液，现用现配。

2.2.2 仪器条件

2.2.2.1 液相色谱条件

色谱柱:Hamilton PRP-X100阴离子交换分析柱(250mm×4.1mmi.d.,10μm)；Hamilton PRP-X100保护柱(25mm×2.3mmi.d.,12-20μm)；流动相:15mmol/L(NH4)2HPO4，p H6.0；流速:1.0mL/min；进样体积:100μL。

2.2.2.2 原子荧光条件

光电倍增管负高压：270V；砷灯总电流：70mA；载气流量：300mL/min；屏蔽气流量：500mL/min；流动相流速：1mL/min；蠕动泵转速：80转/min。

2.2.2.3 氢化物发生条件

载流:7%HCl;硼氢化钾溶液:1.5%KBH4+0.5%KOH

2.2.3 样品处理

准确称取1.0g水产品样或底泥样（干样经粉碎机粉碎后，避光密闭保存，湿样匀浆后冷冻干燥处理，于研钵中研磨，避光密闭保存）于10mL具塞刻度试管中，加入1.2mol/LHCl溶液4mL，混匀，在70℃水浴下恒温震摇1h，使样品被充分浸提。取出冷却，加20%双氧水4mL，再在70℃水浴下振摇1h。取出冷却，取2mL样品溶液（动物源性产品需用0.5mL正己烷脱脂），再加入2mL水摇匀后将所得溶液在3200rpm转速下离心20min，上清液用0.45μm滤膜过滤后上原子荧光形态分析仪测量。

3 结果与讨论

3.1 色谱分离条件的选择

在离子交换色谱分离中，广泛使用磷酸、柠檬酸、硼酸和甲酸的钠盐、钾盐和铵盐，它们与其相应的酸或其他酸相混合，用作缓冲液[3]。经实验中选择15mmol/L(NH4)2HPO4，p H6.0。本实验采用50ng/mL的砷形态混标溶液，分别进行分离效果实验：用10、15、20mmol/L(NH4)2HPO4，以及p H4.0、p H6.0、p H10.0三种不同p H值，试验结果表明流动相为15mmol/L(NH4)2HPO4，p H6.0保证了较好的分离效果和适宜的分离时间，见图1。

图1 砷的特征谱图

3.2 氢化物发生条件的选择

砷在酸性条件下与硼氢化钾溶液反应生成砷化氢，该反应是氢化物发生方法的基础，因此盐酸浓度、硼氢化钾浓度及氢氧化钾的浓度是影响各组分响应的关键因素，本实验针对此分别进行了实验。

3.2.1 盐酸浓度的影响

配制3%、5%、7%、10%、15%不同浓度的盐酸溶液，用50μg/L的砷形态混标溶液进样，采用归一化法考察不同浓度的盐酸对各组分的响应的影响，结果见图2。由图可见，当盐酸浓度为7%时，各组分响应值的最佳。

图2 不同浓度盐酸对砷化氢产生的影响

3.2.2 硼氢化钾浓度的影响

配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%不同浓度硼氢化钾溶液，用50μg/L的砷形态混标溶液进样，采用归一化法考察不同浓度的硼氢化钾对各组分的响应的影响，结果见图3。由图可见，当硼氢化钾浓度为1.5%时，各组分响应值的最佳。

图3 不同浓度硼氢化钾对砷化氢产生的影响

3.2.3 氢氧化钾浓度的影响

配制0.125%、0.25%、0.5%、0.75%、1%不同浓度氢氧化钾溶液，用50μg/L的砷形态混标溶液进样，采用归一化法考察不同浓度的氢氧化钾对各组分的响应的影响，结果见图4。由图可见，当氢氧化钾浓度为0.5%时，各组分响应值的最佳。

图4 不同浓度氢氧化钾对砷化氢产生的影响

3.3 提取溶剂提取剂

实验中常用的3种强酸是盐酸(HCl)、硝酸(HNO3)和硫酸(H2SO4)[4-6]，由于H2SO4的氧化性很强，并具有脱水性，易引起样品炭化；硝酸(HNO3)中的NO3-在阴离子柱上保留极强，对柱效影响远大于Cl-，因此选用HCl做提取剂。称取一定量的紫菜样品，采用不同浓度的HCl提取（见表1），从提取率和提取液中砷形态的变化可得，当HCl浓度为1.2mol/L时，海带的砷提取率均大于90.0%以上，所以采用1.2mol/L的HCl可以达到较理想的提取效果。

表1 紫菜样品在不同酸浓度下的砷提取率

3.4 线性范围与检出限

配制浓度为20、40、60、80、100g/L的混合标准溶液。以质量浓度(x,μg/L)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标作图可得一直线，经最小二乘法计算，得各形态砷的回归方程见表2，在上述条件下，以仪器S/N=3计算，三价砷、一甲基砷、二甲基砷、五价砷的仪器最低检出限分别为0.3、0.9、1.2、7.9μg/L。

表2 不同形态砷的线性回归方程

3.5 加标回收率和精密度试验

在阴性鮰鱼、紫菜及底泥中添加砷的混合标准溶液，添加水平为20μg/kg，按本方法每个添加水平平行测定4次，计算其回收率和相对标准偏差(RSD)。如表3所示，平均回收率为89.99%-97.00%，变异系数为2.05%-4.42%。说明方法的准确度和精密度均达到残留分析要求。

表3 添加回收率及精密度试验 ( n = 4)

4 结论

本文建立了高效液相色谱串联原子荧光光度法测定水产品及其产地环境中中4种形态砷的检测方法。通过对砷提取率、加标回收率和砷形态的转化试验的研究，优化了水产品及产地环境底泥中砷提取剂及其浓度、仪器条件等，该方法前处理简单、回收率稳定、灵敏、准确，杂质干扰少，适用于水产品及产地环境底泥中砷的形态留量的分析。

［1］ 无机化学丛书编写组.无机化学丛书[M].北京: 科学出版社,1984.

［2］Kaise T, Fukui S.The chemical form and acute toxicity of arsenic compounds in marine organisms[J].App.Organomet Chem,1992,6:155-160.

［3］ 曹惠君, 李敏, 徐浩.食品中砷形态分析方法的研究[J].中国卫生检验杂志, 2010, 20(3): 500-505.

［4］ 尚德荣, 宁劲松, 赵艳芳, 等.高效液相色谱 氢化物发生原子荧光(HPLC-HG-AFS)联用技术检测海藻食品中无机砷[J].水产学报，2010，34（1）：135-138.

［5］Mato-Fernández M J, Ote ro-Rey J R, M oreda-Piňeiro J, et al.A rsenic extraction in m arine biological materials using pressurised liquid extraction[J].Talanta,2007,71:515-520.

［6］ 韦璐, 张宏志, 隋涛, 等.流动注射—氢化物发生原子吸收光谱法测定蜂胶样品中的砷和汞[J].检验检疫学刊, 2001, 11(03):18-26.