孟祥慈 黄晓峰 韩 英 王文勇 李永强 亢君君

1.第四军医大学基础医学院中心实验室，陕西西安 710032；2.安徽省萧县人民医院普外科，安徽萧县 235200；3.第四军医大学西京消化病医院，陕西西安 710032；4.第四军医大学基础医学院病理学与病理生理学教研室，陕西西安 710032

家族性结合型高胆红素血症有2种类型：Rotor 综合征和Dubin-Johnson 综合征。Dubin-Johnson 综合征于1954年由Dubin 和Johnson 首先报道，是一种慢性、良性、间歇性黄疸[1]，主要为结合型高胆红素（直接胆红素）血症。由于肝细胞内性质未明色素的沉积使肝脏呈黑色[2]。研究发现沉积的色素颗粒不是黑色素[3]，而溶酶体在某些肝脏疾病中起重要作用，尤其是某些代谢紊乱[4-7]。脂褐素是溶酶体消化后残留的成分，是人类肝脏常见的色素，推测肝细胞脂褐素与这些色素可能有关。本研究主要观察了该综合征肝细胞内颗粒的超微结构特点并与脂褐素颗粒进行了比较。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择第四军医大学西京消化病医院2009年1月～2011年11月门诊和住院的患者18例，其中，男11例，年龄 14～46 岁，平均（26.7±10.3）岁；女7例，年龄 17～48 岁，平均 （34.0±12.5）岁。其中10例患者有典型的 Dubin-Johnson 综合征的表现，如持续性结合型高胆红素血症（直接胆红素升高）、总胆红素为28.2～59.6 μmol/L，直接胆红素为15.3～35.8 μmol/L。肝穿刺组织肉眼呈黑色、肝脏组织学检查正常，肝细胞内有色素沉积、Bromsulphale 清除异常。3例患者只发现黄褐色色素沉积。色素用Gmelin 和铁染色阴性。HE 染色、消化后PAS 染色、Hueck 反应、氨银染色和Schmorl 反应都显示与脂褐素相同。1例入院时有轻度黄疸、恶心、呕吐。在入院前1年出现类似发作。体检发现脱水和轻度黄疸。入院第2天，呕吐停止，4 d 后巩膜黄染消退。4例患者以黄疸入院，体检发现肝脏位于右肋缘下1 cm，无巩膜黄染。所有病例均进行了经皮肝穿刺活检，病理检查确诊为Dubin-Johnson 综合征。

1.2 方法

为进行比较研究，对18例患者的肝脏活检标本进行了透射电镜检查。用于电镜检查的活检标本固定于25 g/L 戊二醛4 h，用10 g/L 锇酸后固定1 h，PBS 洗涤后、梯度酒精脱水、Epon 812 包埋。玻璃刀切半薄切片甲苯胺蓝染色光镜观察定位后，进行70 nm 超薄切片；醋酸铀、柠檬酸铅染色后，JEM-2000EX 透射电镜（日本电子光学有限公司）观察。

2 结果

半薄切片甲苯胺蓝染色发现，肝细胞内有明显色素沉积，主要见于肝细胞毛细胆管周围（图1A）。定位切取含色素颗粒部位肝组织进行超薄切片，铀、铅染色后发现肝细胞内有特征性的单层膜包裹颗粒。大小为0.2～1.0 μm。颗粒大多聚集于毛细胆管周围区域的肝细胞内 （图1B），也可散在分布于肝细胞质内（图1C）。颗粒通常包括3种成分：沉积有铁蛋白样的基质、电子致密体和脂样小滴（图1D）。这些颗粒缺少典型脂褐素颗粒的分叶结构，每个溶酶体部分为多形性，电子密度不一。常存在许多与脂滴相关非常致密的小体，而溶酶体的其余部分由中等电子密度的均一性颗粒物组成，表现为点彩状外观。与脂褐素相比，它们相对富含颗粒状基质，而脂滴样结构少见（图1E），这些颗粒可互相融合，形成更大的不规则结构（图1F）。肝小叶中央区可发现大量无定形颗粒（图1B），这些颗粒缺少脂滴样结构。相反，在肝小叶周围的肝细胞内电子致密小体丰富（图1E）。在某些方面，它们类似脂褐素，但与脂褐素不同的是，某些颗粒内含有明显的致密核心结构。

3 讨论

通常Dubin-Johnson 综合征观察到的颗粒与脂褐素一样由3种成分组成：沉积有铁蛋白样颗粒的基质、电子致密小体和脂滴样结构。肝小叶中央区，颗粒几乎全由基质组成，有时为无定形结构。这些颗粒可能是黑肝的原因。需要强调的是在Dubin-Johnson 综合征肝小叶中央区未发现脂褐素样颗粒，在周围区有些颗粒类似脂褐素。肝细胞脂褐素常在老年人或疾病状态出现。在代谢性障碍、Gilbert综合征[8]、滥用止痛剂、胃溃疡、不明原因肝大患者也曾发现脂褐素颗粒。不同个体，Dubin-Johnson 综合征颗粒的微细结构变化较大，甚至在典型的Dubin-Johnson 综合征病例也是如此。文献中至少有3 类Dubin-Johnson 综合征变型：无黄疸脂色素肝功能障碍、体质性高胆红素血症伴血清非结合胆红素和肝脏脂色素样色素，介于Rotor 和Dubin-Johnson 综合征之间的中间综合征。在某些大家族的Dubin-Johnson 综合征，研究发现色素沉积程度与胆红素血清浓度无关。

综上所述，脂褐素沉积可出现在多种病理情况下，包括体质性高胆红素血症。一般组织化学方法不容易鉴别Dubin-Johnson 综合征的色素以及脂褐素。肝小叶中央脂褐素样色素沉积是Dubin-Johnson 综合征的诊断指标之一，但不具有特异性。正如本研究所发现沉积有铁蛋白样颗粒的基质是Dubin-Johnson 综合征的特点之一，而且颗粒可互相融合，颗粒内还可出现致密核心。这些具有致密核心结构的特殊色素颗粒是其他任何高胆红素血症患者肝活检都没有发现的，可作为Dubin-Johnson 综合征的超微结构特征，具有特殊的诊断价值。这些颗粒与肝脏变色之间的关系以及这些颗粒与高胆红素血症之间的关系还有待研究。

[1]Dubin IN，Johnson FB.Chronic idiopathic jaundice with unidentified pigment in the liver cells：a new clinicopathological entity with a report of 12 cases[J].Medicine （Baltimore），1954，33：155-197.

[2]Shani M，Seligsohn U，Gilon E，et al.Dubin-Johnson syndrome in Israel.Clinical，laboratory and genetic aspects of 101 cases[J].Q J Med，1970， 39（156）：549-567.

[3]Swartz HM，Chen K，Roth JA.Further evidence that the pigment in the Dubin-Johnson syndrome is not melanin [J].Pigment Cell Res，1987，1（2）：69-75.

[4]Cluzeau CV，Watkins-Chow DE，Fu R，et al.Microarray expression analysis and identification of serum biomarkers for Niemann-Pick disease，type C1[J].Hum Mol Genet，2012，21（16）：3632-3646.

[5]Jegadeeswari A，Amuthan V，Janarthanan RA，et al.Two cases of Pompe's disease：case report and review of literature[J].J Indian Heart，2012，64（2）：214-216.

[6]Cotugno G，Annunziata P，Barone MV，et al.Impact of age at administration，lysosomal storage，and transgene regulatory elements on AAV2/8-mediated rat liver transduction[J].PLoS One，2012，7（3）：e33286.

[7]Y évenes LF，Klein A，Castro JF，et al.Lysosomal vitamin E accumulation in Niemann-Pick type C disease [J].Biochim Biophys Acta，2012，1822（2）：150-160.

[8]任东青，黄晓峰，尹文，等.Gilbert 综合征肝活检的超微结构特征[J].现代生物医学进展，2012，12（18）：3439-3441.