王 喆 陆承荣 罗 渊 段连宁 颜克松 战大伟

1.空军总医院临床航空医学中心实验室，北京 100142；2.解放军总医院第一附属医院实验动物科，北京 100048

我国正快速进入老龄化社会，据第六次全国人口普查显示，我国60岁及以上人口已达1.78亿，占总人口的13.26%。预计到21 世纪中叶，我国60岁以上老年人将达到4.8亿，占总人口的34%。随着老龄人口的增加，各种老年疾病也随之而来，如何延缓衰老已成为世界各国学者研究的热点。因此，研究衰老机制、建立衰老动物模型显得尤为重要。近年来，我国老年学研究中广泛将拟自然衰老动物模型应用于衰老机制、衰老过程和抗衰老的研究上，取得了许多研究成果，促进了老年生物学和老年医学的发展。目前用于衰老研究的动物模型有D-半乳糖衰老模型、自然衰老模型、臭氧损伤衰老模型和去胸腺衰老模型等[1]。在衰老研究上以自然衰老动物模型最为理想，但由于饲养周期长、价格昂贵、动物来源不统一、个体间差异大，从而影响实验结果的准确性[2]。虽然D-半乳糖在衰老研究方面应用广泛，但是具体机制还有待进一步证实[3-4]。本实验对皮下注射和腹腔注射D-半乳糖在动物体内导致的自由基代谢、免疫指标及病理变化进行比较，观察其拟衰老效应。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar 大鼠 30 只，体重 250～300 g，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证为SCXK-（军）2007-001。动物饲养在屏障系统内，许可证为SYXK-（军）2007-008。动物适应性饲养1周后，开始正式实验。

1.2 仪器及试剂

紫外/可见分光光度计，美国Beckman 公司；高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；电子天平，上海电子天平仪器厂。D-半乳糖购自上海第一制药厂；氯化钠注射液购自北京双鹤药业股份有限公司；D-半乳糖与氯化钠注射液配成5%D-半乳糖-氯化钠注射液，使用前配制，常规灭菌后使用；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；甲醛溶液购自北京市旭东化工厂。

1.3 实验动物分组

30 只大鼠随机分成对照组、模型1 组和模型2 组，每组各10 只。参照王亚利等[5]、崔美芝等[6]方法进行D-半乳糖衰老模型的建立。模型1 组每天颈部皮下注射D-半乳糖 50mg/（kg·d）；模型 2 组每天腹腔注射 D-半乳糖 500mg/（kg·d）；对照组每天颈部皮下注射等量（50 mg/kg）生理盐水。各组大鼠均每天上午给药，连续给药6周。

1.4 体重、胸腺指数和脾指数测定

每周称重1次。动物处死后迅速取出胸腺及脾，吸去血液，修去脂肪、系膜。用电子天平称取胸腺、脾湿重，根据体重计算胸腺指数、脾指数。

1.5 胸腺和脾病理组织变化

胸腺和脾分别称取湿重后，置于10%中性福尔马林固定液中固定，行常规脱水，石蜡包埋，组织切片，苏木精-伊红（HE）染色，在光镜下进行组织形态学观察。

1.6 血常规、SOD 活性和MDA 含量测定

动物处死前眼球采血，测定血常规；分离血清，采用化学比色法测定SOD 活性和MDA 含量，方法按试剂盒说明书要求进行。

1.7 统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义，以P＜0.01 为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 D-半乳糖对大鼠体重、胸腺指数和脾指数的影响

如表1 所示，与对照组比较，模型1 组和模型2 组大鼠体重增加比例降低，胸腺明显萎缩，胸腺指数明显减少（P<0.01），而脾指数增高，但差异无统计学意义（P ＞ 0.05）；模型1 组和模型2 组间各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 D-半乳糖对大鼠体重、胸腺指数和脾指数的影响（±s，n＝10）

表1 D-半乳糖对大鼠体重、胸腺指数和脾指数的影响（±s，n＝10）

注：与对照组比较，*P<0.01

组别 体重增加比例（%） 胸腺指数（10 g/kg） 脾指数（10 g/kg）对照组模型1 组模型2 组34.06 29.46 28.35 0.11±0.02 0.07±0.03*0.06±0.03*0.20±0.03 0.29±0.03 0.27±0.06

2.2 D-半乳糖对胸腺和脾病理组织形态的影响

病理组织观察显示，对照组胸腺淋巴细胞结构清晰，细胞密集，染色较深；脾细胞结构正常。模型1 组胸腺皮质明显变薄、萎缩，细胞排列稀疏，间隙增大，髓质缩小；脾白髓缩小，细胞减少，红髓扩大并充血。模型2 组胸腺和脾病理变化同模型1 组。说明衰老模型大鼠的胸腺萎缩，脾轻度病理改变。

2.3 D-半乳糖对血常规的影响

如表2 所示，D-半乳糖对血常规无明显影响，三组血常规各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 D-半乳糖对大鼠血常规的影响（±s，n＝10）

表2 D-半乳糖对大鼠血常规的影响（±s，n＝10）

组 别 血红蛋白（g/L）红细胞（×1012/L）白细胞（×1010/L）中性粒细胞（%）淋巴细胞（%）对照组模型1 组模型2 组147.3±8.3 142.8±9.5 143.2±9.6 8.17±0.45 7.76±0.94 7.83±0.92 13.11±1.92 10.38±2.26 10.64±2.31 0.17±0.01 0.15±0.01 0.16±0.01 0.83±0.02 0.85±0.02 0.84±0.02

2.4 D-半乳糖对血清SOD 活性和MDA 含量的影响

如表3 所示，与对照组比较，模型1 组和模型2 组血清SOD 活性显著下降（P<0.01），说明自由基代谢出现异常；血清MDA 含量显著升高（P<0.01），说明D-半乳糖促进机体过氧化产物形成，使动物产生拟衰老效应。

表3 D-半乳糖对大鼠血清SOD活性和MDA含量的影响（±s，n＝10）

表3 D-半乳糖对大鼠血清SOD活性和MDA含量的影响（±s，n＝10）

注：与对照组比较，*P<0.01；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

组别 SOD 活性（NU/mL） MDA 含量（nmol/L）对照组模型1 组模型2 组132.60±16.48 107.97±21.72*108.15±23.26*3.02±0.48 6.58±0.52*6.65±0.73*

3 讨论

建立不同的衰老动物模型是常用的揭示衰老机制和抗衰老研究的实验工具。衰老的机制十分复杂，至今尚未能被充分阐明，而只有研究出生命衰老的机制，才能采取有效的延衰措施，真正延长人类的寿命。当前有关衰老机制的学说多达300多种，其中公认的有免疫学说、自由基学说等[7]。本实验旨在为免疫衰老和自由基衰老研究方面提供更加完善的实验依据。随年龄增长免疫功能出现逐步减退的过程称为免疫衰老。胸腺作为中枢免疫器官，其功能和状态直接影响机体的免疫功能，胸腺的增龄性退化是免疫衰老的直接原因[8]。D-半乳糖衰老模型在机体免疫器官的研究中主要涉及胸腺、脾、淋巴结。本实验结果显示，衰老大鼠胸腺明显萎缩，胸腺指数明显低于对照组，脾指数增高，这与王少康等[9]报道的结果一致。同时病理组织观察胸腺皮质明显变薄、萎缩，细胞排列稀疏，间隙增大，髓质缩小，提示D-半乳糖诱导大鼠免疫器官的衰老是引起机体衰老的重要因素。自由基又称游离基，是具有一个以上的未配对电子的原子或原子团、分子或离子。正常情况下体内自由基的产生和清除保持相对平衡状态。细胞内自由基的清除主要是抗氧化作用，如SOD 可以清除氧自由基，并有随增龄而减低的趋势；自由基的产生可使细胞中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，脂质过氧化产生的MDA 能与蛋白质结合，使之发生交联而丧失功能，并形成脂褐素，可以引起机体的衰老与死亡[10]。本实验结果显示，D-半乳糖致大鼠的血清SOD 活性下降，MDA 水平升高，说明D-半乳糖进入体内引起的氧自由基代谢失衡是诱发衰老的主要原因。

选用D-半乳糖来建立衰老动物模型常用大鼠和小鼠，由于雄性动物的反应较雌性动物反应敏感，大多选择雄性动物，以Wistar 大鼠、SD 大鼠、昆明小鼠和ICR 小鼠最常见，没有种属、月龄和体重的区别。一般采用颈背部皮下注射和腹腔注射两种方法，此外，还有口服给药途径。李春海等[11]给大、小鼠口服 D-半乳糖 700 mg/（kg·d） 连续6周，可造成较好衰老的效应，与皮下注射 70 mg/（kg·d）连续6周造成的衰老效应相似，但某些生化指标检测不及皮下注射给药途径显著。有关D-半乳糖诱导剂量和造模时间目前尚无统一规定。根据文献报道，剂量范围在50～500 mg/（kg·d）连续 6～8 周给药比较合适[12]。本实验采用D-半乳糖 50 mg/（kg·d）颈背部皮下注射和 500 mg/（kg·d）腹腔注射连续6周，试验效果良好，两者比较差异无统计学意义（P<0.05）。同时在造模过程中应注意给药时间应准时，D-半乳糖溶液需密封保存，防止发生变质，并根据动物体重变化调整D-半乳糖注射剂量，注射时采取无菌操作，避免引起大鼠因感染而死亡。

综上所述，采用D-半乳糖颈背部皮下注射和腹腔注射两种方法所致大鼠衰老的效应，具有效果相近、检测指标显著、简便易行、价格低廉、结果稳定的特点。

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