胡德奇 孙 倩 张建军 宋光熠

辽宁省基础医学研究所，辽宁沈阳 110101

大量研究表明，高同型半胱氨酸血症（hyperhomocystinemia，HHcy）引发动脉粥样硬化及相关心脑血管疾病的病理生理机制十分复杂[1-2]。目前，HHcy 动物模型的复制有多种方法。本实验研究采用大鼠灌胃给予蛋氨酸的方法复制HHcy 动物模型，检测动脉硬化的相关指标，并对叶酸+VitB12及苦碟子干预其动脉平滑肌凋亡的作用进行药效学研究。现将研究结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物为体重120～150 g 的Wistar 雌性大鼠，购于沈阳医学院实验动物中心[SCXK（辽）2003-0016，辽宁省科学技术厅签发]。动物饲料为繁殖鼠全价颗粒饲料，由沈阳市于洪区前民饲料厂生产。VitB12，山西云鹏制药有限公司生产（批号：20061107）；叶酸，天津飞鹰制药有限公司生产（批号：20060408）；蛋氨酸粉剂，吉林农业大学提供；同型半胱氨酸（Hcy）、Caspse-3 酶联免疫吸咐（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、TUNEL 检测试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；苦碟子注射液，通化华夏药业有限公司生产（批号：060506）。

1.2 实验方法

雌性Wistar 大鼠28 只在实验室适应性饲养1周后，随机分为4 组，模型组（n=8）给予0.75 g/kg 蛋氨酸灌胃，每天2次；苦碟子组（n=6）给予 0.75 g/kg 蛋氨酸灌胃，每天2次，同时给予7.5 mL/kg 苦碟子注射液灌胃，每天1次；叶酸+VitB12组（n=7）给予0.75 g/kg 蛋氨酸灌胃，每天2次，同时分别给予2.5 mg/kg 叶酸、10 μg/kg VitB12 灌胃，每天1次；空白对照组（n=7）每天给予等容积生理盐水灌胃。连续给药10周后将动物处死，分别取血并分离血浆，ELISA 法检测血浆Hcy、Caspse-3 水平。取胸主动脉并以2.5%戊二醛固定，分别在光学显微镜、电子显微镜下检查其病理改变。TUNEL 法检测胸主动脉平滑肌阳性细胞计数，正常细胞核均匀着蓝绿色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕黄色。于电子显微镜下随机选取1个视野，计数视野中血管中膜细胞TUNEL 染色阳性细胞数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

与空白对照组比较，模型组大鼠血浆Hcy 明显升高，TUNEL 胸主动脉平滑肌阳性细胞计数增多，血浆Caspse-3含量升高（均P<0.01），提示Wistar 雌性大鼠灌胃给予蛋氨酸0.75 g/kg，每天2次，连续10周可诱发HHcy。与模型组比较，药物干预各组TUNEL 胸主动脉平滑肌阳性细胞计数减少，血浆Caspse-3 含量降低（均P<0.01）。叶酸+VitB12组血浆Hcy 浓度下降，与模型对照组比较，差异有高度统计学意义（P<0.01）。见表1。光学显微镜显示：模型组大鼠血管壁的病理改变为内皮损伤，平滑肌增生，在内膜下及平滑肌有炎性细胞浸润；空白对照组大鼠血管壁未见病理改变；药物干预各组内皮损伤、血管平滑肌增生和炎性细胞浸润程度均较模型组大鼠明显减轻。电子显微镜显示：模型组大鼠病理改变为血管平滑肌细胞肿胀十分明显，内质网呈扩张状态，线粒体水肿，溶酶体明显增多；叶酸+VitB12组、苦碟子组及空白对照组均未见上述改变。

表1 各组大鼠血浆Hcy、Caspse-3、TUNEL胸主动脉平滑肌阳性细胞计数（±s）

表1 各组大鼠血浆Hcy、Caspse-3、TUNEL胸主动脉平滑肌阳性细胞计数（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01；Hcy：同型半胱胺酸

组别例数 Hcy（μmol/L）Caspse-3（μg/L）TUNEL 胸主动脉平滑肌阳性细胞计数（个）模型组空白对照组叶酸+VitB12 组苦碟子组8776 115.04±10.97 6.98±2.09*17.46±6.13*116.27±14.54 1.31±0.12 1.02±0.07*1.09±0.13*1.16±0.12*17.68±2.41 2.86±0.89*5.71±2.47*10.00±3.32*

3 讨论

大量研究表明，Hcy 可能是通过诱导内皮功能紊乱、血管平滑肌增生、促进脂蛋白氧化、增加血小板活性、增加胶原蛋白合成导致动脉粥样硬化[3]。近年研究表明，细胞凋亡亦是Hcy 致动脉粥样硬化的机制之一，Hcy 可促进内皮细胞及血管平滑肌凋亡，并且呈浓度依赖性关系[4]。在正常血管和动脉粥样硬化各个阶段血管平滑肌都存在凋亡，但动脉粥样硬化的血管平滑肌凋亡数量较正常血管明显增加[5-7]。本实验证实，Hcy 可引发动脉粥样硬化促进大鼠血管平滑肌凋亡，叶酸+VitB12和苦碟子可降低血浆Caspse-3含量，抑制血管平滑肌凋亡。叶酸、VitB12抑制血管平滑肌凋亡可能与降低血浆Hcy 含量进而抑制其病理过程密切相关。苦碟子对Hcy 的代谢无明显影响，但对HHcy 的影响是多方面的，其具有抗过氧化、抑制细胞因子异常分泌等作用[8-10]，其抑制Caspse 依赖性的细胞凋亡机制可能与上述作用有关，但相关的信号传导途径有待进一步研究。

[1]Wald DS，Wald NJ，Morris JK，et al.Folic acid，homocysteine，and cardiovascular disease：judging causality in the face of inconclusive trial evidence[J].BMJ，2006，333（7578）：1114-1117.

[2]Jacobsen DW.Homocysteine and vitamins in cardiovascular disease[J].Clin Chem，1998，44（8）：1833.

[3]Welch GN，Loscalzo J.Homocysteine and atherothrombosis[J].N Engl J Med，1998，338（15）：1042-1050.

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[8]宋光熠，姜雅秋，张建军，等.苦碟子对高同型半胱氨酸血症IL-8、MCP-1 的影响[J].吉林医学 2008，29（7）：539-540.

[9]宋光熠，姜雅秋，张建军，等.苦碟子对高同型半胱氨酸血症IL-6、CRP 的影响[J].吉林医学 2008，29（9）：709-710.

[10]宋光熠，姜雅秋，张建军，等.苦碟子对高同型半胱氨酸血症ICAM-1、VCAM-1、MCP-1 表达的影响[J].中国老年学杂志，2008，28（7）：660-661.