胡丹丹 刘哲 邵淑娟 杨娟 王建福

虹鳟（Oncorhynchusmykiss）在分类学上属鲱形目、鲑科、大麻哈鱼属，是一种冷水性鱼类，原产美国加利福尼亚，1874年经人工移植驯化在世界许多地方养殖。中国黑龙江省1959年首次从朝鲜引进虹鳟进行养殖，目前中国已有20多个省（市）开展了虹鳟养殖［1］。随着养殖规模的不断扩大，一些恶性传染性疾病流行的机会增大，而且在有些地方已经形成严重危害，因此开展虹鳟抗病功能基因的研究，进而通过分子标记进行抗病育种，在预防和控制疫病的流行和蔓延方面具有非常重要的意义。

主要组织相容性复合体（majorhistocompatibility complex，MHC）基因是存在于脊椎动物体内编码MHC分子的一类基因家族，具有高度多态性。其编码产物是一种位于细胞表面的糖蛋白，广泛参与免疫应答的诱导和调节，因此与动物对疾病的抗性和易感性密切相关，在免疫学上具有极为重要的意义［2］。因其具有高度的多态性，因此也是研究脊椎动物适应性进化的候选基因之一［3］。按照MHC基因编码蛋白分子的不同可以分为3类，分别为MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子和MHC Ⅲ类分子。MHCⅠ类分子是由 α链（α1、α2、α3）和β2-微球蛋白（β2m）通过非共价键形成的异二聚体，α1和α2结构域构成槽型的抗原肽结合区，分别由MHCⅠ类基因的第2和第3外显子区编码，主要负责内源性抗原（如病毒）的加工和呈递，将内源性抗原肽呈递给CD8+细胞毒性T细胞。

最早对MHC的研究是在20世纪50年代，从小鼠等哺乳动物开始的。鱼类MHC研究起步较晚，1990年，Hashimoto等［4］率先克隆了鲤鱼MHCⅠ基因，随后，在许多鱼类中都发现MHC多态性与机体抗病力密切相关，如牙鲆（Paralichthys olivaceus）［5］、大西洋鲑（Salmo salar）［6］、虹鳟（Oncorhynchusmykiss）［7］、欧江彩鲤（Cyprinus carpiovar Color）［8］等，因此MHC的研究已成为鱼类分子免疫学和鱼类抗病辅助育种的研究热点之一。目前挪威和澳大利亚的科学家已利用MHC基因作为分子标记成功地筛选出了大西洋鲑的抗病品系［6］。

虹鳟MHCⅠ类基因家族包括Ⅰa区和Ⅰb区，UBA基因为Ⅰa区的一个经典的有义基因座位，位于18号染色体的长臂［9］，包括7个外显子和6个内含子［10］。Dijkstra等［11］发现虹鳟被传染性造血器官坏死病病毒（infetioushaematopoietic necrosis virus，IHNV）感染后，UBA 基因在性腺细胞系中的表达量上升；Landis等［12］发现，虹鳟在被病毒感染后，Ⅰ类 b区基因（ 包 括 UAA、UCA、UDA、UEA和UGA）的表达量也上升，说明了MHCⅠ类基因在虹鳟抵抗病毒感染方面具有重要作用。本研究采用聚合酶链式反应-单链构象多态性（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）和克隆测序的方法分析了虹鳟UBA基因第2外显子多态性，以期为进一步筛选抗病相关的分子标记，并进行虹鳟抗病育种工作奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用184尾虹鳟来自于同一养殖条件。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取肌肉组织用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，TE溶解，经1％琼脂糖凝胶检测，-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计和PCR扩增 引物设计参照Gen-Bank中虹鳟MHC基因序列（登录号AB162342），通过Primer Premier 5.0软件设计上游引物UBA-F：5'-TGTCTACCTTACAGCTACGC-3'，下游引物UBA-R：5'-CTCACCTCCAGTCTGATTG-3'（TaKaRa合 成 ）。PCR反应体系25μL，包括模板基因组DNA 1.0μL，上 下 游 引 物 各（10 pmol/μL）1.0μL，dNTP（2.5mmol/L）1.0μL，10×buffer（ 含 Mg2+）2.5μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2μL，ddH2O 18.3μL。PCR反应程序：94℃ 3min；94℃ 30s，55.5℃ 30s，72℃30s，32个循环；72℃延伸10min。经2％琼脂糖凝胶检测，-20℃保存备用。

1.2.3 单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析 取 2μL的 PCR产物，加入8μL的变性上样缓冲液（98％去离子甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％ 二甲苯青、10mmol/L EDTA）。98℃变性10min，迅速冰浴10min后上样于非变性聚丙烯酰胺凝胶中，电泳所用聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶N，N'-亚甲双丙烯酰胺=39∶1）浓度为12％。电泳条件为室温（约12℃）250 V预电泳30min，然后160 V电泳18h，电泳结束后银染法显带。具有相同带型的个体可推断其基因型相同。

1.2.4 目的片段胶回收和克隆测序 对不同SSCP带型个体PCR产物进行分离纯化，将所得片段与pMD19-T载体（TaKaRa）连接，并转入大肠杆菌DH5α菌株（Tiangen）。通过菌液PCR扩增筛选阳性克隆，每个样品随机挑取8个阳性克隆，由上海生物工程有限公司测序。

1.2.5 等位基因命名 等位基因命名参考哺乳动物及其它脊椎动物中广泛采用的MHC基因命名规则［13］，即在位点名称后用一个星号“*”和数字代表一个特异的等位基因，星号前为基因座位，星号后为等位基因。等位基因的分型以MHC基因同源序列所编码氨基酸间的错义替换超过或等于5个残基作为一个等位基因主型，少于5个残基的变异作为主型中的一个亚型。如等位基因Onmy-UBA*0201，Onmy代表虹鳟拉丁学名两个单词前两个字母，UBA表示MHC的Ⅰ类a区的一个基因，前两位数字“02”表示该等位基因所属的等位基因主型，后两位数字“01”表示亚型。

1.2.6 数据统计分析 获得的序列通过NCBI中的BLAST同源检索，确认是否为目的片段。用MEGA5.0软件分析核苷酸序列和氨基酸序列的变异位点、平均碱基组成、平均氨基酸含量、密码子使用频率，确定等位基因个数，并构建邻接（Neighbor-Joining，NJ）系统发生树（选择Kimura两参数模型，用Bootstrap法进行1000次评估）。用DnaSP5.10.01软件Jukes ＆ Cantor模型计算UBA第2外显子整个序列，PBR区和Non-PBR区核苷酸同义替换率（dS）和非同义替换率（dN）。使用U检验进行选择压力检测。

2 结果

2.1 虹鳟UBA基因第2外显子PCR扩增及SSCP分型结果

利用引物UBA-F、UBA-R对虹鳟UBA基因第2外显子进行扩增，得到一条280bp左右的特异性条带（图1），经测序，包含第2外显子的全部序列（261bp）。所有PCR产物经SSCP分析后，获得6种不同的带型。

图1 虹鳟UBA基因第2基因外显子PCR产物检测

2.2 虹鳟UBA基因第2外显子等位基因数

对6种带型对应的样品进行克隆后测序（共测序48个克隆，每个样品8个克隆），检测到虹鳟UBA基因第2外显子等位基因12个（GenBank中序列登录号：JX136662-JX136673）。除Onmy-UBA*0106与GenBank中登录号为AB162342的UBA第2外显子序列相同外，其余11个为首次发现。单个个体所包含的等位基因数为1-4个（表1），有70个个体只检出1个等位基因，等位基因数为3和4的个体数分别为41和73，未检出等位基因数为2的个体。

表1 个体中UBA基因外显子2等位基因数及相应的个体数

2.3 虹鳟UBA基因第2外显子核苷酸和氨基酸序列的变异

261bp的核苷酸序列比对后发现存在16个核苷酸变异位点（图2），变异百分率6.13％，变异范围1-4个位点。氨基酸序列比对后发现86个氨基酸残基存在15个变异位点（图3），占17.44％，变异范围在1-4之间。PBR区核苷酸变异百分比为6.25％，氨基酸变异百分比为18.75％，Non-PBR区核苷酸变异百分比为6.10％，氨基酸变异百分比为17.14％。虹鳟UBA基因第2外显子等位基因Onmy-UBA*0103和Onmy-UBA*0105测序部分峰图序列比较，图中显示了第2外显子的31bp和49bp处分别发生了T/C和A/G突变（图4）。

2.4 虹鳟UBA基因第2外显子等位基因密码子使用情况

虹鳟UBA基因第2外显子密码子的使用存在明显的偏倚现象，其中CAG使用频率最高，为8.02％，其次是ACU、GAC分别为5.70％、5.58％。并且多个同义密码子的使用也表现出了偏倚性，例如编码亮氨酸（Leu）的6个密码子中，CUG使用频率达到了95.24％，CUU使用频率为4.76％，而其他的4种密码子却没有使用（表2）。在所编码的氨基酸序列中，只有等位基因UBA*0201含有20种氨基酸，其它等位基因均不含半胱氨酸（Cys）。且氨基酸平均含量有较大差异，如：天冬氨酸（Asp）平均含量为9.06％，而半胱氨酸（Cys）平均含量为0.11％。

图2 虹鳟UBA基因第2外显子核苷酸序列分析结果

图3 虹鳟UBA基因第2外显子氨基酸序列分析结果

图4 虹鳟UBA基因第2外显子测序部分峰图

表2 虹鳟Onmy-UBA基因第2外显子等位基因密码子的使用

2.5 选择压力检测

UBA基因第2外显子全序列dN与dS分别为0.012 6和0.002 9，PBR 区dN为0.014 3而dS为 0，Non-PBR区dN与dS分别为0.012 4和0.003 6。用U检验进行选择压力检测的结果是，全序列、PBR区和Non-PBR区的dN都极显著大于dS（P＜0.001）（表3）。

表3 UBA 基因第2外显子、PBR区、Non-PBR区核苷酸同义替换率和非同义替换率

2.6 UBA基因第2外显子等位基因间系统发生分析

采用MEGA5.0软件根据等位基因间核苷酸序列变异构建邻接系统发育树，分析了本研究所发现的

虹鳟Onmy-UBA基因第2外显子序列（JX136-662-JX136673）和从GenBank下载的大西洋鲑Sasa-UBA基因部分第2外显子序列（JN561333，JN561336，JN561337，JN561338，AY762573，AY762575，AY762583，AY762587，AY762589，AY762593，AY762595，AY762597） 以 及 斑 马 鱼Dare-UBA基因（NM131471，BC164159）之间的系统发生关系。结果（图5）显示，虹鳟和大西洋鲑UBA基因起源于同一分支，尤其是等位基因Sasa-UBA*3101和Sasa-UBA*2501与Onmy-UBA基因表现为高度同源性，表明虹鳟与大西洋鲑UBA基因的亲缘关系较近。

图5 Onmy-UBA，Sasa-UBA和Dare-UBA基因第2外显子邻接系统发育树

3 讨论

3.1 MHC基因多态性

MHC作为脊椎动物基因组中高度多态的区域，不同物种间基因座位数有所不同［14，15］。本研究从单个个体扩增出等位基因数为1-4个，暗示虹鳟UBA基因至少存在两个拷贝位点。已往研究认为虹鳟MHCⅠ类基因包括Ⅰa区和Ⅰb区，Ⅰa区仅存在一个经典的UBA基因座，Ⅰb区包含UAA、UCA、UDA、UEA、UFA、UGA，其中 UFA为假基因。且Ⅰb区基因起源于Ⅰa区基因，由UBA复制后转化而来［16，17］。本研究发现的UBA多座位现象不同与以往的研究。等位基因数为4的虹鳟有73尾（表1），说明扩增结果并非偶然。为排除扩增结果为Ⅰb区基因的可能，将UBA（JX136662）与UAA（AF091779）、UCA（AB162343）、UDA（AB162343）、UEA（AB162343）、UFA（AY071855）、UGA（HM208332）第2外显子序列进行比对，序列同源性分别为46.12％、67.44％、67.05％、54.92％、65.13％和62.45％，而UBA基因外显子2的12个等位基因之间同源性为98.08％-99.23％。说明本研究所设计的引物特异性较高，扩增目的片段为UBA基因第2外显子。其存在多座位的原因可能来源于染色体的复制，有研究表明现存二倍体虹鳟的祖先为四倍体，虹鳟在进化过程中MHC经历了复制事件，而且与四倍体发生时间相近［18］。Kiryu［19］认为外显子改组可能会导致虹鳟UBA基因存在另一拷贝位点，但对此还需要进一步的研究证明。有关MHCⅠa区基因多座位的现象在斑马鱼（Danio rerio）［20］、大西洋鲑［21］和青（Oryzias latipes）［22］中已得到证实。

此外，MHC多态性还表现在每个基因座都存在大量的等位基因。王海燕等［23］研究发现青石斑鱼的MHC I类的5个等位基因，Grimholt等［24］分别在大西洋鲑和金头鲷中发现了UBA的12个和2个等位基因。夏春等［25］对草鱼 MHCⅠ类基因研究也发现，α1和α2区域存在大量插入/缺失突变。本研究发现UBA等位基因12个。Aoyagi等［17］的研究也证明了虹鳟UBA基因第2外显子存在高度多态性，且变异主要发生在抗原肽结合区，这导致了个体在免疫力上存在差异。引起MHC基因多态性的动力主要是环境中的病原压力［26，27］。

3.2 选择压力检测

很多关于MHC基因序列多态性的研究都证明了MHC基因的多态性是正向选择的结果［28，29］。非同义替换率和同义替换率的比值可以用来检测任何一段DNA序列的平衡选择［30］，一般认为 dN/dS＜1（P＜0.05）是受到负向选择的作用，dN/dS=1为平衡选择的结果，dN/dS＞1（P＜0.05）为正向选择的作用［31，32］。参照人类HLA I类分子的三维结构，对虹鳟UBA基因的PBR位点进行了界定［33，34］，UBA基因外显子2全序列、PBR区及Non-PBR区的dN均极显著大于dS（P＜0.001），可以认为虹鳟UBA基因在进化过程中主要受到正向选择的作用。此外，氨基酸含量的差异性及密码子使用频率的不同都说明了虹鳟UBA基因在进化过程中受到选择压力，导致了对密码子使用存在偏倚性。

3.3 MHC在抗病育种中的应用

MHC作为与免疫相关的基因家族，不同等位基因具有不同的抗病能力，这已在包括鱼类的很多物种中被证明［35，36］。Johnson等［7］发现虹鳟Ⅰ类b区基因在抗细菌冷水病的作用，并筛选出8个和该区基因紧密连锁的标记，Miller等［37］将大西洋鲑对IHNV有抗性的基因位点定位在非经典的MHCⅠ类基因上，Kjglum等［6］发现大西洋鲑的Ⅰ类的UBA基因与IHNV抗病性相关，并且已利用MHC基因作为分子标记成功地筛选出了大西洋鲑抗IHNV的抗病品系。虹鳟、大西洋鲑和斑马鱼UBA等位基因间系统发生关系表明，虹鳟UBA基因与大西洋鲑UBA基因亲缘关系较近，推测虹鳟UBA基因可能具有与大西洋鲑UBA基因相似的功能，有望作为虹鳟抗病育种的一个潜在遗传标记，尤其在鲑鳟鱼类易感的传染性造血器官坏死病抗病育种中具有应用价值。

4 结论

从虹鳟UBA基因第2外显子的序列中发现了12个等位基因，有11个为首次发现。单个个体最多存在4种等位基因，说明虹鳟UBA基因存在多拷贝位点（至少2个）。虹鳟UBA基因第2外显子多态性丰富，且在进化过程中受到正向选择的作用，可望作为抗病育种应用中的一个潜在遗传标记。

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