郭莉娜 徐英春 楮云卓 吕火祥 陈冬梅 佟明庆 刘勇 席丽艳 施毅 俞云松 周新0

(1.中国医学科学院 北京协和医学院，北京 100730;2.中国医科大学附属第一医院，沈阳 110001;3.浙江省人民医院，杭州 310014;4.中山大学附属第一医院，广州 510080;5.江苏省人民医院，南京 210029;6.中国医科大学附属第二医院，沈阳 110004;7.中山大学附属第二医院，广州 510120;8.南京军区总医院，南京 210002;9.浙江大学附属第一医院，杭州 310003;10.上海市第一人民医院，上海 200080)

近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂的大量应用，肿瘤放化疗，器官移植以及艾滋病的流行，深部真菌感染越来越多。引发深部真菌感染的病原体排在前三位的依次为念珠菌，新生隐球菌和曲霉菌［1-2］。治疗真菌感染的药物有很多，但是受抗菌谱，耐药性和药物相互作用的影响，可供我们选择的抗真菌药物常常是有限的。重视并重新评估现有抗真菌药具有重要意义，如伊曲康唑，随着静脉滴注剂型的应用，能够快速达到有效血药浓度并具有较好的生物利用度。伊曲康唑在人体内经肝脏细胞色素P450-3A4同工酶系统代谢为多种产物，其中羟基伊曲康唑是伊曲康唑的主要活性代谢产物，有报道称羟基伊曲康唑与伊曲康唑有相似的抗菌活性［3］。本研究收集了10家医院共338株真菌临床分离株，微量肉汤稀释法测定伊曲康唑及其代谢产物羟基伊曲康唑的体外抗菌活性，并进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2007～2008年全国十家医院深部真菌感染真菌的338株，其中念珠菌和新生隐球菌分离自血液和无菌体液，曲霉菌分离自气管插管吸取物，支气管肺泡灌洗液和保护性毛刷。

1.2 实验材料

API 20C AUX(法国生物梅里埃公司);沙堡弱培养基(英国OXOID公司);科玛嘉显色培养基(英国OXOID公司);RPMI1640液体培养基 (Invitrogen公司)，含谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，缓冲液用MOPS溶液，并调整pH至6.9～7.1，过滤除菌，4℃保存备用;伊曲康唑 (ITZ)和羟基伊曲康唑(HO-ITZ)粉末由西安杨森公司提供。

1.3 菌种鉴定

酵母样菌落经科玛嘉显色培养基进行鉴定，不能鉴定到种者采用API 20C鉴定;曲霉菌经乳酸酚棉兰染色压片，根据镜下特点鉴定到种。

1.4 体外药敏试验

微量肉汤稀释法严格按照美国临床实验室标准化协会 (CLSI)规定，酵母菌参照 M27-A3［4］，曲霉菌参照M38-A2［5］进行。伊曲康唑和羟基伊曲康唑的测定浓度范围为 0.031 3 ～16 μg/mL，孵育条件:将96孔板置35℃温箱中孵育并观察菌落生长情况，念珠菌和曲霉菌孵育48 h，新生隐球菌为72 h;质控菌株为ATCC22019近平滑念珠菌，随实验菌株平行操作。

1.5 结果判读

对念珠菌和新生隐球菌来说，相对于生长对照孔50%菌落生长被抑制时的浓度为最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，对曲霉菌来说，相对于生长对照孔100%菌落生长被抑制时的浓度为最低抑菌浓度MIC。伊曲康唑:MIC≤0.125 μg/mL 为敏感株 (S)，0.25 ～0.50 μg/mL 为剂量依赖性敏感株 (SDD)，≥1.0 μg/mL为耐药株 (R)［4］。

2 结 果

2.1 质控菌株对伊曲康唑的敏感性

据CLSI规定，ATCC22019的MIC范围为0.12～0.5 μg/mL。本实验中质控菌株药敏结果均在上述范围内，本实验结果可靠。

2.2 各医院菌株分离情况

按比例分别从各家医院选取酵母菌和曲霉菌若干，见表1。

2.3 真菌的鉴定结果

338株真菌分离株中，白念珠菌99株，占29.29%;热带念珠菌72株，占21.3%;光滑念珠菌50株，占14.79%;近平滑念珠菌42株，占12.43%;新生隐球菌18株，占5.33%;克柔念珠菌13株，占3.85%;季也蒙念珠菌3株，占0.88%;奥默毕赤酵母2株，占0.59%;葡萄牙念珠菌1株，占0.3%;菌膜念珠菌 1 株，占 0.3%;黄曲霉20株占5.92%;烟曲霉14 株，占 4.14%;黑曲霉3 株，占 0.88%。

2.4 药敏结果

伊曲康唑 (ITZ)对白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌的敏感率较高，分别为83.8%，70.8%，78.6%;克柔念珠菌敏感株只有38.5%，一半多菌株为剂量依赖性敏感，也提示临床在选择抗真菌药物时慎重考虑不同种病原体的药敏特点以及药物剂量对治疗效果的影响。伊曲康唑对光滑念珠菌敏感性较差，耐药率达72%，见表2。

表2 伊曲康唑对276株念珠菌的敏感性(%)Tab.2 Sensitivity of itraconazole against 276 Candida isolates(%)

体外药敏结果显示，伊曲康唑对新生隐球菌、烟曲霉和黄曲霉有较好的体外活性，其中MIC50/MIC90分别为 0.5/0.5 μg/mL、1/1 μg/mL、1/1 μg/mL;100%试验新生隐球菌体外MIC≤1 μg/mL，超过92%曲霉菌体外MIC≤1 μg/mL(见表3)。

羟基伊曲康唑作为伊曲康唑主要的体内代谢产物，显示了与伊曲康唑相近但对部分菌种略弱的体外抗菌活性。如果以MIC≤1 μg/mL为临床有效进行分析，羟基伊曲康唑对白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、新生隐球菌的抗菌活性与伊曲康唑类似，MIC50/MIC90分别为0.25/1 μg/mL、1/2 μg/mL、0.25/0.5 μg/mL、1/1 μg/mL、0.5/1 μg/mL。但是对热带念珠菌、黄曲霉、烟曲霉的活性较伊曲康唑差些，MIC50/MIC90分别为0.5/32 μg/mL、1/2 μg/mL，1/4 μg/mL(见表3)。同伊曲康唑类似，羟基伊曲康唑同样存在剂量依赖现象，当 MIC≤0.125 μg/mL时，羟基伊曲康唑对本研究菌株少部分有活性或没有活性，但是随着浓度增加活性明显增强。

3 讨 论

侵袭性真菌感染已经成为免疫缺陷患者健康的最大杀手之一，而三唑类药物是治疗侵袭性真菌感染的常用药物。虽然新型三唑类药物如伏立康唑，泊沙康唑等相继出现，为临床医生治疗真菌感染提供了更多选择，但是由于真菌耐药株的出现以及患者经济负担等方面的因素，评价并利用好经典抗真菌药物具有重要意义。伊曲康唑在中国应用于抗真菌治疗将近20 a［6］，其作用机制和其他三唑类药物一样，主要干扰真菌细胞膜麦角固醇的生物合成。早期应用时，口服胶囊制剂生物利用度差，血浆浓度很难达到0.5 μg/mL，故其应用受到限制。随着伊曲康唑静脉注射剂型的应用，其生物利用度得到了较大的改善，血浆峰浓度很容易达到2～4 μg/mL［7］，所以选择伊曲康唑作为抗真菌治疗的常用药物成为一种可能。

目前CLSI推荐的伊曲康唑药敏折点 (敏感MIC≤0.125 μg/mL;剂量依赖性敏感 MIC 0.25 ～0.5 μg/mL;耐药 MIC≥1 μg/mL)适用于黏膜念珠菌感染且适用于传统口服剂型，考虑到新剂型的应用，使得伊曲康唑血药浓度较容易达到2～4 μg/mL，可以认真考虑重新评估伊曲康唑的活性并建立合理的敏感性判定折点。

本研究显示，光滑念珠菌和克柔念珠菌对伊曲康唑的耐药现象严重，以 MIC≤0.125 μg/mL为敏性感判定折点，敏感率分别为14%和38.5%，与Pfaller等［7］报道相符，但国内另外两家医院在同时期的数据显示伊曲康唑对光滑念珠菌和克柔念珠菌的敏感率大于80%以上［8-9］，这种差异的出现可能和各医院患者来源以及抗生素使用习惯有一定的关系，只可惜本研究中每家医院不同种菌株各收集3～5株，以期具有较广泛的代表性，但同时受菌株数限制，不便于比较不同医院之间各个种的耐药性差异。条件允许的情况下，我们会继续收集更多的菌株，做更全面的研究。

通常认为新生隐球菌MIC≤0.5 μg/mL为敏感［10］，本研究95%以上的新生隐球菌为敏感，无明显耐药株出现;研究中伊曲康唑对烟曲霉和黄曲霉有较好的体外活性，90%以上菌株MIC≤1 μg/mL，且从MIC分布来看 (见表3)，烟曲霉和黄曲霉对伊曲康唑的敏感性相似，没有发现耐药株。有报道称由于唑类药物被广泛地用来预防和治疗侵袭性曲霉菌病，会容易出现对伊曲康唑敏感性降低的烟曲霉菌株［11］，所以对于感染人群实时监测曲霉菌体外敏感性将有助于临床大夫合理选择抗生素和患者的早日康复。

表3 338株真菌对ITZ和HO-ITZ的体外药敏结果Tab.3 In vitro activities of itraconazole and hydroxyl-itraconazole against 328 fungal isolates

羟基伊曲康唑与伊曲康唑有相似的抗菌活性，但其抗菌活性浓度依赖现象明显，当MIC≤0.125 μg/mL时，抑菌活性明显低于伊曲康唑;随着浓度增加到1 μg/mL时，羟基伊曲康唑对大部分真菌抑菌活性增加，且与伊曲康唑相似，只有对于热带念珠菌，黄曲霉和烟曲霉的活性较伊曲康唑差一些(见表3)。伊曲康唑的主要代谢产物有较好的抗菌活性，在一定程度上避免了抗生素的“首过效应”，体现了较好的临床应用价值。

本研究采用微量肉汤稀释法，大范围地评价了中国10家医院的338株深部感染真菌对伊曲康唑和羟基伊曲康唑的体外抗菌活性，丰富了我国真菌耐药监测数据，并为临床大夫合理选择抗真菌药物提供参考。

［1］Pfaller MA，Diekema DJ.Epidemiology of invasive candidiasis:a persistent public health problem［J］.Clin Microbiol Rev，2007，20(1):133-163.

［2］Hsueh PR，Lau YJ，Chuang YC，et al.Antifungal susceptibilities of clinical isolates ofCandidaSpecies，Cryptococcus neoformans，andAspergillusspecies from Taiwan:surveillance of multicenter antimicrobial resistance in Taiwan program data from 2003［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(2):512-517.

［3］Mouton JW，Peer A，Beule K，et al.Pharmacokinetics of Itraconazole and Hydroxyitraconazole in healthy subjects after single and multiple doses of a novel formulation［J］.Antimicrob A-gents Chemother，2006，50(12):4096-4102.

［4］Wayne PA.CLSI:Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts.Approved standard-Third Edition.CLSI doccument M27-A3［S］.Clinical and Laboratory Standards institute，2008.

［5］Wayne PA.CLSI:Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi.Approved standard-Second Edition.CLSI doccument M38-A2［S］.Clinical and Laboratory Standards institute，2008.

［6］冉玉平.伊曲康唑在中国临床应用16年回顾--广谱篇［J］.中国真菌学杂志，2011，6(6):169-173.

［7］Pfaller MA，Boyken L，Hollis RJ，et al.In vitrosusceptibilities of clinical isolates ofCandidaspecies，Cryptococcus neoformans，andAspergillusspecies to itraconazole:global survey of 9，359 isolates tested by clinical and laboratory standards institute broth microdilution methods［J］.J Clin Microbiol，2005，43(8):3807-3810.

［8］栗方，曹彬，杜小玲，等.医院内深部真菌感染的临床分布特点及耐药性分析［J］.中国真菌学杂志，2008，18(12):1771-1773.

［9］张妍蓓，何凤莲，徐轲，等.702株假丝酵母菌属感染的菌种鉴定及药敏结果分析［J］.中国真菌学杂志，2008，18(8):1195-1197.

［10］孙继海，王艳玲，周秀珍.新生隐球菌感染12例临床特点及实验室检测的回顾性分析［J］.中国真菌学杂志，2011，6(3):154-157.

［11］Burgel PR，Baixench MT，Amsellem M，et al.High prevalence of azole-resistantAspergillus fumigatusin adults with cystic fibrosis exposed to traconazole［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(2):869-874.