张 盼， 兰新芝， 乔 奇， 张德胜，秦艳红， 田雨婷， 王 爽， 张振臣＊

（1.河南省农业科学院植物保护研究所，郑州 450002；2.河南省农作物病虫害防治重点实验室，郑州 450002；3.河南省新县农业局植保站，新县 465500）

甘 薯 病 毒 病 害 （sweet potato virus diseases，SPVD）是由甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）和甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）协生共侵染甘薯引起的病毒病害［1］。感染SPVD的甘薯表现植株矮化，叶片褪绿、畸形等症状。SPVD对甘薯产量影响极大，严重时可造成90%以上的产量损失，甚至绝收，是甘薯上的毁灭性病害［2－3］。张振臣等［4］利用血清学、分子生物学和嫁接传染试验等方法首先发现了SPVD在我国的发生，目前主要分布在广东、江苏、四川、安徽和福建等地。为了加强对SPVD的预警和控制，防止该病的进一步蔓延危害，有必要建立快速、高效的检测技术。

用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附技术（ELISA）和PCR技术，ELISA检测技术耗时长、灵敏度较低，而且需要分别检测SPCSV和SPFMV才能确定SPVD是否存在。另外，SPCSV在中国存在2个株系（EA和 WA），SPFMV存在4个株系（O、RC、EA和C），其中 O、RC和EA 3个株系的关系相对较近，将它们归为一类，称之为SPFMV CH 株系类型（SPFMV－CH）；C株系与其他3个株系的关系较远，称之为SPFMV CH2株系类型（SPFMV－CH2）。目前已有人建议将C株系划分为一个新种［5］。由于SPCSV与SPFMV不同株系的互作可能引起不同的产量损失［6］，目前利用ELISA方法还不能有效区分SPFMV的不同株系。而利用单一的RT－PCR进行检测时，需要进行多次PCR反应，工作量大，效率低。多重RT－PCR技术是近年发展起来的一种可用于多种病原体检测的技术，具有特异性强、灵敏性高的特点，能在较短时间内同时完成多种病原的检测，尤其适合于甘薯上一些容易混淆又常常混合侵染的病毒的检测［6－7］。本研究建立了在一次PCR反应中即可检测SPVD是否存在的方法，并且该方法可有效区分SPFMV的两个株系类型，可为SPVD的快速检测以及对该病的监测预警提供技术手段。

1 材料和方法

1.1 病毒材料及质粒

分别在广东惠州、四川南充、江苏徐州等地采集具有典型SPVD症状的甘薯茎蔓栽种于防虫温室中，分别利用血清学方法和普通RT－PCR方法检测SPCSV和SPFMV，以确定感染SPVD的甘薯植株，并通过测定SPFMV外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列来确定SPFMV的株系类型，最后选定若干个SPVD感病植株备用。含SPFMV－CH、SPFMVCH2、甘 薯 潜 隐 病 毒 （Sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯脉花叶病毒（Sweet potato vein mosaic virus，SPVMV）CP 基因以及SPCSV Hsp70基因的重组质粒由本实验室构建并保存［8－9］。将经过NCM－ELISA和 RT－PCR检测SPCSV 和SPFMV为阴性的甘薯脱毒试管苗作为阴性对照。从洛阳农林科学院试验田分别采集感染SPVD的甘薯叶片和薯块用于所建立的多重RT－PCR方法的验证。

1.2 酶及试剂（盒）

UNIQ－10柱式总RNA抽提试剂盒为上海生工生物工程公司产品；UNIQ－10柱式DNA胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术公司；RNase抑制剂、AMV反转录酶、Taq DNA聚合酶、pMD19－T载体、T7RNA Polymerase购自TaKaRa公司。其他常用试剂为国产分析纯。

1.3 引物的设计与合成

根据NCBI GenBank中登录的SPCSV Hsp70基因和SPFMVCP基因的核苷酸序列设计了4对特异性引物（表1），引物由上海生工生物工程公司合成。

表1 多重RT－PCR扩增的特异性引物Table 1 Specific primers for multiplex RT－PCR amplification

1.4 核酸提取

利用上海生工生物工程公司的Flash UNIQ柱式总RNA抽提试剂盒提取感病甘薯叶片的总RNA。甘薯薯块总RNA的提取参照杨元军等［10］方法进行。

1.5 单一RT－PCR

以提取的感病甘薯叶片总RNA为模板，反转录反应体系为10μL，包括2μL 5×RT buffer，1μL MgCl2（25mmol／L），1 μL dNTP 混 合 物 （各10mmol／L），0.5μL CSV2引物或0.5μL FMV 2引物，0.25μL RNase抑制剂（40U／μL），0.5μL反转录 酶 （AMV Reverse Transcriptase）（5U／μL），4.25μL样品RNA，DEPC－H2O 0.5μL。反应程序为：42℃反转录40min，99℃5min，5℃5min。

PCR反应体系为25μL，包括2.5μL 10×PCR buffer（Mg2＋－），0.2μL Taq 酶（5U／μL），0.5μL上游引物（CSV 1、FMV 1、FMVCH 或 FMVCH2）（10 μmol／L），0.5μL下游引物（CSV 2或 FMV 2）（10 μmol／L），1μL dNTP混合物（各10mmol／L），1μL MgCl2（25mmol／L）；以2μL反转录产物为模板，用dd H2O补足至25μL。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳、UVP凝胶成像系统观察和照相。

1.6 多重RT－PCR反应条件的筛选

以单一RT－PCR反应体系为基础，对影响多重RT－PCR的主要反应条件进行优化，在优化某一条件时，其他条件不变。退火温度分别设50.0、51.9、53.7、55.3、57.6 ℃和60.0 ℃ 6个处理；dNTP 混合物（各2.5mmol／L）分别设0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μL 6个处理；MgCl2浓度（25mmol／L）分别设0、0.5、1、1.5、2、2.5μL 6个处理，Taq 酶（5U／μL）分别设0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μL 6个处理；引物浓度（10μmol／L）设4个处理，引物FMV1∶FMVCH∶FMVCH2∶FMV2∶CSV1∶CSV2的加入量分别为（1）0.2μL∶0.2μL∶0.4μL∶0.8μL∶0.4μL∶0.4μL；（2）0.2μL∶0.4μL∶0.4μL∶1.0μL∶0.4μL∶0.4μL；（3）0.2μL∶0.4μL∶0.6μL∶1.2μL∶0.6μL∶0.6μL；（4）0.2μL∶0.3μL∶0.5μL∶1.3μL∶0.5μL∶0.5μL。

1.7 多重RT－PCR的特异性试验

1.7.1 几种甘薯病毒RNA体外转录产物的制备

按照T7RNA Polymerase说明书进行RNA体外转录。在上游引物的5′端引入T7启动子序列，分别以SPFMV－CH、SPFMV－CH2、SPLV、SPVMV的CP基因和SPCSV Hsp70基因的重组质粒为模板，进行PCR扩增，扩增的双链DNA片段在T7 RNA聚合酶的作用下经体外转录形成单链RNA（cRNA），纯化后用核酸测定仪测定cRNA浓度，根据阿伏伽德罗常数将浓度换算为拷贝数。

1.7.2 多重RT－PCR的特异性试验

利用甘薯上常见的两种Potyvirus病毒SPLV和SPVMV测试特异性。分别以浓度为106拷贝／μL的 SPCSV、SPFMV－CH、SPFMV－CH2、SPLV、SPVMV的体外转录RNA为核酸模板，进行多重RT－PCR扩增，检测多重RT－PCR的特异性。

1.8 多重RT－PCR的灵敏性试验

分别将SPCSV、SPFMV－CH、SPFMV－CH2的体外转录RNA，进行10倍梯度稀释，分别取浓度为108～101拷贝／μL的8个浓度梯度的RNA作为核酸模板，进行多重RT－PCR扩增，以检测其灵敏性。

1.9 多重RT－PCR产物的克隆和序列测定

将纯化后的多重RT－PCR产物分别与pMD19－T载体连接，连接产物转化大肠杆菌TG1，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成。利用DNAMAN和BLAST对所测序列进行比较分析［9］。

1.10 多重RT－PCR的初步应用

从田间分别采集了10份感染SPVD的甘薯叶片样品和7份薯块样品，按照1.4中的方法提取总RNA，利用建立的多重RT－PCR方法对样品进行检测。

2 结果与分析

2.1 多重RT－PCR反应条件的筛选

试验结果表明，退火温度在50～55.3℃之间的扩增效果都比较好；dNTPs加入量在1μL以上时均能很好地扩增出全部目的条带；当Mg2＋加入量达到0.5μL时就能够扩增出全部目的条带，并且随浓度的增加条带越来越亮，但当 Mg2＋加入量为2.5μL时，各目的条带的亮度反而变弱；Taq DNA聚合酶加入量为0.2μL时，能清晰地扩增出全部目的条带，随着酶量的增加，没有很大的变化；4种引物浓度组合的扩增效果都比较好，不同组合对扩增效果影响不大（图略）。

根据不同条件对试验结果的影响，综合考虑扩增效果和试验成本，最终优化的多重RT－PCR反应体系为：多重RT反应体系为10μL：2μL 5×RT buffer，1μL MgCl2（25mmol／L），1μL dNTP 混合物（各10mmol／L），0.5μL CSV2引物，0.5μL FMV2引物，0.25μL RNase抑制剂（40U／μL），0.5μL 反 转录酶 （AMV Reverse Transcriptase）（5U／μL），4.25μL样品 RNA。反应程序为：42℃反转录40min，99℃5min，5℃5min。多重PCR反应体系为25μL：2.5μL 10×PCR buffer（Mg2＋－），0.3μL Taq 酶（5U／μL），1.5μL dNTP Mixture（各2.5mmol／L），1.5μL MgCl2（25mmol／L），0.5μL引物CSV1，0.5μL引物CSV2，0.2μL引物FMV1，1.3μL引物FMV2，0.3μL引物FMVCH，0.5μL引物FMVCH2，2μL反转录产物，ddH2O补足25μL。反应程序为：94℃ 预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃ 延伸10min。

2.2 多重 RT－PCR与单一 RT－PCR扩增效果的比较

以同时感染SPCSV以及SPFMV 2个株系类型的SPVD甘薯植株叶片总RNA为模板，利用建立的多重RT－PCR反应体系对样品进行扩增，结果表明，多重RT－PCR扩增结果与单一RT－PCR的扩增结果一致（图1）。

图1 多重和单一RT－PCR检测结果比较Fig.1 Comparison of the test results between multiplex RT－PCR and single RT－PCR

2.3 多重RT－PCR的特异性分析

体外转录的RNA经纯化后测定RNA的浓度，各目的cRNA的浓度与拷贝数见表2。利用建立的多重RT－PCR方法对浓度为106拷贝／μL的SPFMVCH2、SPFMV－CH、SPCSV、SPLV和SPVMV几种病毒的cRNA进行扩增。结果显示，从SPFMV－CH、SPFMV－CH2和SPCSV的cRNA以及两两混合的cRNA和3种混合的cRNA中均能扩增出相应的目的条带，而从SPLV和SPVMV中均未扩增出条带。说明建立的多重RT－PCR特异性较好（图2）。

表2 各目的基因体外转录合成RNA的浓度与拷贝数Table 2 Concentrations and copies of RNA synthesized from the objective gene in vitro

图2 多重RT－PCR的特异性检测Fig.2 Specific detection by multiplex RT－PCR

2.4 多重RT－PCR的灵敏性分析

灵敏性试验结果表明，建立的多重RT－PCR方法对SPFMV－CH2、SPFMV－CH 和SPCSV 的最低检测浓度分别为1.42×104拷贝／μL、1.32×104拷贝／μL和2.47×104拷贝／μL（图3）。说明该方法可实现对2种甘薯病毒RNA104拷贝水平的检测。

2.5 多重RT－PCR扩增产物的鉴定

为了进一步验证多重RT－PCR扩增出的片段为目的病毒的核酸序列，对部分多重RT－PCR的扩增产物进行了克隆和序列测定。结果表明，所扩增出的4个片段的核苷酸序列与GenBank中SPFMV和SPCSV核苷酸序列的一致性最高分别达92%、96%、98%和97%左右，说明扩增出的片段均为目的病毒的特异性片段。

图3 多重RT－PCR的灵敏性Fig.3 Sensitivity of multiplex RT－PCR assay

2.6 多重RT－PCR检测方法的初步应用

分别对10份感染SPVD的甘薯叶片样品和7份薯块样品进行了检测，结果表明，本研究所建立的多重RT－PCR方法能从叶片和薯块中检测出SPVD的两种病原，并且能够区分SPFMV的两个主要株系类型。例如，对甘薯叶片的检测中，样品1含有SPFMV－CH株系和SPCSV 2种病毒，样品6含有SPFMV－CH、SPFMV－CH2和SPCSV 3种病毒；对甘薯薯块的检测中，样品2含有SPFMV－CH株系和SPCSV 2种病毒，样品6含有SPFMV－CH2株系和SPCSV 2种病毒（图4、图5）。

3 结论与讨论

本文设计了针对SPFMV和SPCSV所有株系的通用引物，同时还设计了能区分SPFMV 2个主要株系类型（CH和CH2）的特异性引物。通过优化反应条件，初步建立了在一次PCR反应中即可检测SPVD是否存在的方法，该方法可用于甘薯植株和薯块中病毒的检测。SPVD是甘薯上的毁灭性病害，建立SPVD快速高效的检测技术，对于该病的预警和控制具有重要意义。

影响多重RT－PCR扩增效果的因素很多。例如，扩增的目的片段应尽量选择小片段，各片段大小的差距要适中，以减小扩增效率不均衡对扩增效果的影响［11］。本研究设计的扩增片段均小于600bp，有效减小了扩增效率不均衡的影响。在引物设计方面，不同引物之间互补的碱基不能太多，避免引物之间形成二聚体等。Tm值相近的引物更有利于多重RT－PCR扩增［12］。另外，在一个PCR反应体系中同时加入多个引物，引物之间的竞争也会影响扩增效果。由于当SPCSV和SPFMV共同侵染甘薯时，SPCSV的含量变化不明显，而SPFMV的含量会比其单独侵染时增加600倍［13］，因此本研究适当提高了SPCSV引物的浓度，达到了比较好的扩增效果。

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