郑国华， 苏勇波， 郑志忠， 彭德伟， 明艳林＊

（1.厦门华侨亚热带植物引种园，国家农作物国外引种隔离检疫基地，厦门市引种检疫与植物源产物重点实验室，厦门 361002；2.厦门兆翔花卉科技有限公司，厦门 361010）

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）属于马铃薯X病毒属（Potexvirus）成员，是危害兰科植物最为严重的病毒之一［1］。调查表明国内兰花普遍受到该病毒的危害，特别是蝴蝶兰、文心兰、大花蕙兰、墨兰等兰花种类［2－3］。该病毒基因由约6200nt的单链正义RNA组成，5′端带有一个甲基化的核苷酸帽子结构，3′端带有一个poly（A），共编码RNA聚合酶、TGBp1、TGBp2、TGBp3和CP等5个蛋白［4］。Potexvirus属病毒的CP在病毒复制、组装和移动等过程中都发挥着重要的作用［5］，因此CP基因被广泛用于开展介导抗病毒研究［6］。国内外学者先后将CyMV的CP基因转入石斛兰（Dendrobium）原球茎［7］、本塞姆氏烟（Nicotiana benthamiana）［8］、西方烟（Nicotiana occidentalis）［9］等寄主，发现病毒的复制和积累受到明显抑制，展示了CP基因介导抗性的优势。但是在马铃薯Y病毒和番木瓜环斑病毒等CP基因介导应用研究中发现，CP基因介导的转基因植株对不同分离物的抗性存在着明显的差异［10－11］，从而限制了该抗性技术的应用。CyMV 分离物间CP基因（相似性85%～100%）存在明显遗传变异性［12］，因此有必要分析病毒CP基因遗传变异和进化趋势，寻找稳定遗传的保守序列开展抗性基因的研究。

正单链RNA病毒3′UTR的序列及其二、三级结构在病毒RNA复制酶启动合成负链RNA时具有非常重要的作用，许多研究发现3′UTR可以通过形成的茎环结构、类tRNA结构和Poly（A）等方式参与病毒复制调控［13］。目前，Potexvirus属的竹花叶病毒（Bamboo mosaic virus，BaMV）3′UTR结构与功能研究较为深入，BaMV的3′UTR能够形成类似三叶草茎环结构A、B、C和D，形成类似tRNA的假结结构［14］。RDRP能特异结合3′UTR，启动负链RNA的合成，敲除3′UTR不同部位都能影响RNA复制［15］。CyMV与BaMV同属于Potexvirus，具有非常相似的基因组成，因此研究CyMV 3′UTR的结构和功能将有可能进一步揭示病毒复制调控机制。

本文采用单链构象多态性分析（single－strand conformation polymorphism，SSCP）快速检测侵染不同蝴蝶兰品种CyMV存在的遗传变异，从中筛选得到5个存在变异的分离物并测定其CP和3′UTR基因序列。进一步与其他分离物的CP基因进行比较分析，研究CP基因存在的遗传多样性和作用于CP基因的选择压力，为开展抗病毒研究奠定基础。并通过软件预测3′UTR二级结构，以期为深入研究该复制调控区域的结构和功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 病毒毒源

蝴蝶兰病株采自厦门蝴蝶兰种植圃（品种编号：pl335、kq5503、kq6113、kf540、kf1023、jt1017、ypm166、j02037），均为组培分生苗，叶片出现褪绿、花叶和环斑等症状。经斑点酶联免疫检测筛选后，将病叶研磨后摩擦接种到曼陀罗上进行单斑分离和保存。采用接种建兰花叶病毒的曼陀罗病叶作为阳性对照，并以未接种病毒的曼陀罗叶片作为阴性对照。

1.1.2 试剂

CyMV斑点酶联检测试剂由本实验室制备。cDNA合成试剂盒、Taq聚合酶购自Promega公司。内切酶Pst I、T－A克隆试剂盒、感受态细胞JM109、Trizol试剂盒、DNA胶回收试剂盒等均购自上海生物工程有限公司。分析已知分离物间的保守序列，根据保守序列设计3条引物，委托上海桑尼生物工程有限公司合成。引物5Fa（对应AM055640的4900～4923nt）：5′－GTGTTAGCTTTTACTGCAGTGATC－3′、引物4R（与 AM055640的5278～5298nt 互 补 ）：5′－ATTGCCAGGATGGTAGGAAA－3′；引 物 M4T（与 poly（A）互 补 ）：5′－GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTT－3′，其中5Fa／4R引物对预期扩增条带大小为399bp，5Fa／M4T引物对预期扩增条带约为1350bp。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR

采用Trizol试剂盒分别提取8个样品、阳性对照和阴性对照叶片总RNA，采用cDNA合成试剂盒合成cDNA。用5Fa／M4T引物对扩增部分TGB－ps、全长CP和3′UTR基因序列，PCR扩增体系如下：50μL 总体积包括 10 × PCR buffer 5μL、dNTP mix（10mmol／L）1μL、引物5Fa（10μmol／L）和 M4T（10μmol／L）各2μL、cDNA 1μL、Taq酶（5U／μL）0.4μL；补充ddH2O至50μL。PCR反应程序：94℃预变性10min，先进行94℃45s、50℃30s、72℃120s5个循环后将退火温度提高58℃再进行24次循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.2.2 SSCP

取PCR产物稀释1×105后作为模板，用5Fa／4R引物对扩增TGB部分序列，PCR扩增体系同1.2.1。PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃30s、58℃20s、72℃30s，共24个循环，72℃延伸5min。扩增产物经胶回收试剂盒回收纯化后，取纯化产物2μL加入4μL上样缓冲液（95%甲酰胺、0.5%溴酚蓝），混匀后于95℃变性10min，取出立即冰浴5min后上样。将电泳槽置于4℃冰箱内，先使用10V／cm电压电泳5min后，改用4V／cm电压电泳12h。EB染色30min后在紫外灯下观察。

1.2.3 序列测定与分析

将5Fa和M4T扩增得到的8份PCR产物经胶回收试剂盒回收纯化后，分别与pUCm－T载体进行连接转化DH5α，筛选得到pUmcy07（pl335）、pUmcy11 （kq5503）、pUmcy18 （kq6113）、pUmcy42（kf540）、pUmcy46（kf1023）、pUmcy54（jt1017）、pUmcy58（ypm166）和pUmcy59（j02037）等阳性克隆，委托上海生物工程有限公司进行序列测定。通过 Clustal Omega－Multiple Sequence Alignment（http：∥www.ebi.ac.uk／Tools／msa／）软件进行序列分析，通过基于Nei ＆Gojobori方法的SNAP在线分析软件（http：∥www.hiv.lanl.gov／content／sequence／SNAP／SNAP.html）分析CP基因各位点非同义置换率（dN）和同义置换率（dS）值。采用RNAshapes软件分析3′UTR形成的二级结构。

2 结果

2.1 RT－PCR扩增结果

经1%的琼脂糖凝胶电泳分析发现，采用5Fa和M4T这对引物从来自8个蝴蝶兰品种的CyMV分离物中均能扩增得到1300bp左右的目的条带。由于M4T引物与Poly（A）结合位点略有不同，扩增片段大小应该存在一定差异，但这种差异在电泳图中没有得到体现（图1）。PCR产物经稀释后作为模板采用5Fa和4R这对引物进行扩增均能得到400bp左右的目的条带（图2）。

图1 引物对（5Fa和M4T）PCR扩增产物电泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR products using the primers 5Fa／M4T

图2 引物对（5Fa和4R）PCR扩增产物电泳分析Fig.2 Electrophoresis of PCR products using the primer 5Fa／4R

2.2 变异分离物筛选

采用SSCP对5Fa和4R扩增得到的8个产物进行分析，发现经过优化SSCP条件均得到稳定的带型（图3）。8个分离物扩增片段均出现2个条带，总共有5个带型，其中kf1023、jt1017和ypm166带型一 致，kf540、j02037 带 型 一 致，pl335、kq5503、kq6113分离物带型差异明显。通过条带存在的多态性，推测这8个分离物由5种存在明显差异的分离物组成。进一步提取8个分离物重组质粒委托测序，结果表明5Fa和4R扩增片段大小均为399bp。通过序列分析比对发现，pUmcy46（kf1023）、pUmcy54（jt1017）和 pUmcy58（ypm166）序列一致，pUmcy42（kf540）、pUmcy59（j02037）序列一致，其他3个分离物各不相同（图4），与SSCP分析结果一致。

图3 PCR产物单链构象多态性电泳分析Fig.3 Electrophoresis of SSCP products of 8isolates

图4 8个分离物扩增片段碱基变异分析Fig.4 Molecular differentiation of 8isolates

2.3 CP基因进化树分析

根据SSCP分析和序列测定分析结果，本文对pl335、kq5503、kq6113、kf1023、j02037等分离物 CP基因进行分析，通过分析发现它们的相似性为95.5%～99.9%。从已知GenBank登录的130个分离物CP基因序列中选择具有代表性的56个登录序列和本研究的5个序列建立系统进化树（图5），分析表明这5个分离物都属于亚组A。其中pl335（图5：Phalaenopsis－pUmcy07）、kq6113（Phalaenopsis－pUmcy18）和 kf1023（Phalaenopsis－pUmcy46）3个分离物间相似性为99.4%～99.9%，与来自厦门（GQ507023）、广东（FJ356061）蝴蝶兰分离物亲缘性较近（相似性为98.1%～98.8%）。kq5503（Phalaenopsis－pUmcy11）和 j02037（Phalaenopsis－pUmcy54）2个分离物间相似性为97.6%。与来自浙江（DQ067884、DQ067885）、福建（DQ067879）、广东（AY360410）建兰分离物亲缘性较近（95.2%～97.6%）。分析分离物间的地理分布和寄主发现，各分离物间不存在明显的地域和寄主相关性。

2.4 CP基因dN和dS的分析

对CP基因各碱基非同义替代率（dN）和同义替代率（dS）进行计算，dN 平均为0.0418，dS平均为0.1205，平均dN／dS为0.3379，说明CP基因全长仍然为负向选择。通过SNAP分析的dN和dS分布（图6），可以看到CP的N端dN＞dS，表明受到正选择压力的作用，氨基酸发生变异的频率较高；而CP的C端dN＜dS，表明受到负选择压力的作用，在病毒进化过程中会净化这些变异。

图5 CP基因系统进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree based on CP nucleotide sequences between different isolates of CyMV

2.5 3′UTR二级结构预测

分析3′UTR序列发现含有Potexvirus属病毒RNA合成必需的顺式元件“AC（C／T）TAA”和Poly（A）信号“AATAAA”。采用RNAshapes软件预测3′UTR形成的二级结构，发现该区域能够形成类似三叶草茎环结构（图7A），顺式元件位于茎环结构A中，推测该区域在启动负链RNA合成的过程中具有重要作用。

图6 CP基因核苷酸的非同义替代率（dN）和同义替代率（dS）Fig.6 Cumulative plot of average nonsynonymous nucleotide substitution（dN）and average synonymous nucleotide substitution（dS）represented codon by codon

进一步分析各分离物的3′UTR存在的遗传变异（图7B），发现10位（A／T）、28位（C／T）、31位（A／T／G）、47位（G／A）、59位（A／T／C）、60位（A／T／G）、61位（C／T）等变异位点均位于未配对区域，它们间的变异没有改变茎环结构；位于配对区域的49位（C／T）和68位（A／G）则是分别形成 A－T和G－C配对的稳定结构。56位碱基A出现缺失和突变为G的情况降低了茎环稳定性。由此可见，各分离物进化过程中始终保持这种二级结构的稳定，推测这种结构对病毒具有重要意义。

3 讨论

Zhou等［16］根据CP基因序列相似性进行进化树分析，认为CyMV分离物间亲缘关系与地理位置大体相关，亚洲各分离物和夏威夷分离物以很高相似系数聚集在一起，欧洲各分离物集成一大类，新加坡的一个分离物和泰国分离物是特例。Moles等［17］则明确这两类分离物划分为亚组A和亚组B。本文通过将这5个分离物与其他分离物进行比对，结果发现它们都属于亚组A，未发现亚组B成员。进一步分析各分离物CP基因的非同义替代／同义替代率，发现该CP基因5′端存在较高的非同义替代，推测该区域的变异是病毒应对不同寄主和环境选择压力的策略。CP基因3′端普遍发生同义替代，编码的氨基酸序列较为保守，因此可以作为抗性研究的重点。

图7 CyMV 3′非编码区茎环结构预测Fig.7 Stem－loop structure prediction of CyMV 3′UTR

CyMV 3′UTR形成的类似三叶草的茎环结构在同属的BaMV已经得到验证，而且CyMV不同分离物间的变异始终都维持着这种结构的稳定性，由此可以推测这种结构对于病毒具有非常重要的作用。但是目前仅仅通过分子结构的热力学稳定性进行模拟，其结构和功能还有待进一步的试验验证。

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