叶保国 李新白 张文文 朱庆三 宋雪松 (吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 3002)

学习和记忆的分子基础是修饰神经元突触产生脑电活动，即突触可塑性。神经元通过几种形式改变突触强度，使得长时程增强(LTP)时特异的突触活动增强，长时程抑制(LTD)时特定的突触活动削弱。Arc是长期记忆形成所特别需要的，并影响所有这些突触可塑性的形式。Arc在大脑的谷氨酸能神经元表达以适应行为和学习增强的突触活动〔1～4〕，其转录和蛋白质合成的定位被严格调控，在树突〔5，6〕、突触后密集区〔5，7，8〕和核〔9，10〕高度表达。通过基因敲除(KO)去除 Arc，虽然不影响短期学习，但不能形成长期记忆〔11〕。记忆无疑受衰老和疾病的影响，已研究报道在衰老的海马Arc基因转录和蛋白表达水平下降，但有关幼年阶段Arc与记忆能力的关系未见研究报道。本文拟了解不同发育阶段影响记忆能力的基因的表达水平，以探索疾病导致突触可塑性功能障碍的分子机制。

1 材料与方法

1.1 水迷宫 水迷宫为圆形水槽，直径130 cm，高50 cm，池

水深32 cm，加入黑色食用色素，测试过程中使水温保持(26±1)℃，测试过程室温保持(20±2)℃。房间光照恒定。在水槽壁上按方位等距离、以不同形状的剪纸标记四个点S、N、E、W，并依此顺序作为放入鼠的位点，在N和W点形成的区域内距离槽壁28 cm处放置一平台，直径11 cm、高30 cm，使其位于水面下2 cm，并用3层白色纱布包裹缚牢，修剪整齐。在水槽正上方安置连接显示器的摄像头，同步记录大鼠的移动轨迹。

1.2 主要试剂和动物 抗大鼠Arc抗体，Abgent公司;HRP标记二抗IgG，DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。雄性SD大鼠，SPF级，由吉林大学实验动物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 Morris水迷宫实验 取2月龄和6月龄鼠各12只作为实验组，其余2月龄和6月龄大鼠各12只作为各自的对照组，进行水迷宫训练。将鼠放到平台上适应10 s取下，将大鼠随机从不同象限面壁放入水中，观察其能否找到平台。若在水中转一圈仍找不到，则引导其找到，待鼠登上平台后10 s取下，重复上述过程一次。训练实验结束4 h后，进行定位航行实验。取受训过的鼠从规定的第一点面壁放入水中，计时鼠登上平台的时间，为逃避潜伏期。最长记录时间为90 s，若大鼠在90 s内不能登上平台，其逃避潜伏期计为90 s，同时记录大鼠在平台象限的停留时间，即进入平台象限到登上平台的时间。顺次从标记的4个点分别完成该过程，2次的时间间隔为15～20 min。每次实验结束时将鼠放入保温箱内吹干，放回鼠笼。每天如此进行定位航行实验，共3 d。

1.3.2 免疫组化检测大鼠海马Arc的表达 断头处死大鼠，剥离海马组织，固定、包埋、切片后，脱蜡、脱水，抗原修复后，BSA封闭2 h;滴加Arc抗体(1∶500)，37℃孵育过夜，PBS洗涤3次;滴加HRP标记的二抗(1∶1 000)，37℃孵育2h，PBS洗涤3次;DAB显色。镜下观察，照相。

1.4 统计学分析 采用SPSS16.0软件行t检验。

2 结果

2.1 不同月龄大鼠在平台象限停留时间 水迷宫实验结果显示，随着入水次数的增加，2月龄和6月龄大鼠在平台象限停留时间逐渐缩短(P＜0.05或P＜0.01)，2月龄大鼠每天每次在平台象限停留时间比6月龄大鼠长;随着训练天数的增加，2月龄大鼠平台象限停留时间明显缩短(P＜0.01或P＜0.001)，6月龄大鼠停留时间也缩短，但无统计学意义至第2天、第3天6月龄大鼠停留时间已趋于稳定，表明6月龄大鼠形成记忆能力较强，较快形成长期记忆。虽然第3天2月龄大鼠停留时间接近6月龄大鼠，但其记忆形成能力不稳定。每天2月龄大鼠第4次入水停留时间比第3次有所升高，考虑是受方位及年龄等因素影响。见表1。

表1 2月龄、6月龄大鼠水迷宫实验平台象限停留时间(，S，n=12)

表1 2月龄、6月龄大鼠水迷宫实验平台象限停留时间(，S，n=12)

与 S点比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

时间点 S 2月龄 6月龄N E W月龄第一天 19.71±9.88 9.84±8.14 13.94±9.521) 7.03±5.94 5.55±5.551) 4.91±3.56 7.89±5.042)2月龄 6月龄2月龄 6月龄2月龄 6 4.99±5.66第二天 9.85±5.92 7.37±5.46 6.91±5.50 3.39±2.011) 2.98±1.14 4.07±5.20 3.87±3.692) 3.65±3.27第三天 5.27±4.71 2.89±1.56 3.53±1.72 3.74±3.23 2.90±1.60 3.09±2.74 5.81±3.68 5.35±7.67

2.2 免疫组化分析Arc在大鼠海马的表达 进行行为训练的大鼠Arc表达量高于未接受行为训练的对照组大鼠，且接受行为训练的6月龄大鼠Arc表达量高于2月龄大鼠。见图2。

图2 免疫组化检测水迷宫实验的2月龄和6月龄大鼠海马Arc的表达(×100)

3 讨论

大脑对外界信息的存储和处理是通过神经元突触相互连接形成的网络来完成的。众所周知，大脑长期存储信息是依赖于快速的、从头的RNA和蛋白的合成，分子合成是长期形成突触可塑性如LTP和LTD必不可少的，突触可塑性是学习和记忆的基础。立即早期基因Arc(也称为Arg3.1)是将行为与神经元活动信息最紧密耦联的分子〔12〕。

Arc是高度保守的单拷贝基因，在许多种不同的行为模式均可被诱导，具有重现性。Guzowski等〔12〕应用荧光原位杂交方法检测出5 min空间探索训练可诱导约40%海马CA1神经元的Arc转录，证实了在体内Arc可促进海马和皮质完成学习功能。而这一区域易受到伤害进入衰老状态，同正常衰老一样影响记忆功能。但幼龄阶段Arc的转录和表达水平不清楚。本文结果表明6月龄大鼠形成记忆能力较强，较快形成长期记忆。虽然第3天2月龄大鼠停留时间接近6月龄大鼠，但其记忆形成能力不稳定，且易受方位及年龄等因素影响。免疫组化检测结果表明不同月龄大鼠Arc的表达水平不同，其表达水平直接影响大鼠的学习、记忆形成能力。

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11 Plath N，Ohana O，Dammermann B，et al.Arc/Arg3.1 is essential for the consolidation of synaptic plasticity and memories〔J〕.Neuron，2006;52(3):437－44.

12 Guzowski JF，Timlin JA，Roysam B，et al.Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate－early gene expression〔J〕.Curr Opin Neurobiol，2005;15(5):599－606.