玄香兰 安昌善 周彩存

吉非替尼是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI），是目前最常用的治疗非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）的分子靶向药物。由于吉非替尼对特殊患者的选择性，仅部分NSCLC患者对吉非替尼有效，存在原发或获得耐药，这种耐药机制不十分明确。新近研究[1,2]显示，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）及其受体MET参与NSCLC细胞对吉非替尼耐药。本研究选择NSCLC细胞EGFR突变型PC-9、PC9/R和EGFR野生型H292、A549，用HGF诱导这4株细胞，应用MTT法检测细胞增殖，Annexin V-FITC法检测细胞凋亡，利用蛋白质免疫印迹技术检测c-Met及下游通道蛋白的表达，验证c-Met及下游信号通道参与HGF诱导不同基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药。

1 材料与方法

1.1 材料 人NSCLC细胞株PC9（EGFR突变型，敏感株）、H292（EGFR野生型，敏感株）、PC9/R（EGFR突变型，获得性耐药株）、A549（EGFR野生型，原发性耐药株）均由上海市肺科医院中心实验室提供；吉非替尼原料购自济南汇丰达化工有限公司；HGF购自Humanzyme；MTT粉购自AMRESCO；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit 1购自美国BD；兔抗人p-Met（Tyr1349, 145 kDa）、c-Met（190/56 kDa），p-Akt（Ser473, 60 kDa）、Akt（59 kDa），Erk1（44 kDa），p-Stat3（Ser727, 92 kDa）、Stat3（92 kDa），GAPDH（35 kDa）购自EPITOMICS，p-Erk1/2（Tyr202/Y204, 42/44 kDa）购自CST，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自JECTION；NC膜购自Whatman；ECL化学发光试剂购自Thermo。

1.2 细胞培养 分别将PC9、H292、PC9/R、A549细胞常规培养于含10%新生牛血清的DMEM培养液中，置于5%CO2、37oC恒温细胞培养箱中培养，每3-4天换液传代1次。

1.3 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的细胞用胰酶消化，每100 μL含细胞数为5×10³个的细胞悬液接种于96孔板。细胞贴壁后，每孔内加入干预药物及细胞因子。72 h后，每孔内加入20 μL MTT（5 mg/mL），放入细胞培养箱中孵育。4 h后，1,200 rpm、10 min离心，弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，摇床上混匀约30 min至结晶完全溶解，用酶标仪测量波长530 nm时OD值。细胞存活率=（实验组平均OD值-空白组平均OD值）/（对照组平均OD值-空白组平均OD值）×100%。……