林丽云，董晓洁，陈阿微

（韩山师范学院生物系，广东潮州 521000）

黄豆脲酶的提取及其活性测定

林丽云，董晓洁，陈阿微

（韩山师范学院生物系，广东潮州 521000）

摘 要：对市售黄豆进行了脲酶提取研究，通过pH增值法对脲酶活性进行测定，并确定黄豆脲酶的最佳提取方案。结果表明，提取黄豆脲酶的最佳方案为：采用干黄豆为原料，以30%乙醇溶液提取脲酶粗酶液，用分级沉淀的方法对粗酶液里的脲酶进行分离，采用Sephadex G-150凝胶层析过滤装置对脲酶液进行纯化，用真空冷冻干燥技术对脲酶液进行干燥浓缩，得到酶活力最高的脲酶。

关键词：黄豆；脲酶；分级醇沉；凝胶过滤；冷冻干燥

脲酶作为重要的生物制剂，广泛分布于植物的种子中，但以黄豆、刀豆中含量丰富。黄豆中的脲酶，是一种寡聚酶，分子量约为293 500，等电点为3.9，具有绝对专一性，特异性地催化尿素水解释放出氨和二氧化碳。

随着我国经济、科技的迅速发展，脲酶的需求量越来越大。但就目前来说，脲酶在我国尚未形成自主的生产能力。商品化的脲酶产品主要由巨豆提取，而国内又缺乏巨豆资源，对脲酶的迫切需求使我们不得不长期依赖进口。本实验以价格低廉、来源丰富的市售黄豆为原料提取脲酶；建立从黄豆中提取脲酶的全套流程，包括粗酶液的提取、脲酶的分级沉淀、分离纯化，及酶液的干燥；对所提取的脲酶活性进行检测，为脲酶的分离、纯化及应用提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 主要原料

市售黄豆：购买于潮州市韩山师范学院附近菜市场。

1.2 主要试剂

Sephadex-G150：西安朴天生物科技有限公司，BR；尿素：上海源叶生物科技有限公司，BR；无水乙醇、甘油和丙酮均为分析纯试剂。

1.3 主要仪器

TGL-16R冷冻高速离心机：珠海黑马医学仪器有限公司；pH-3c精密酸度计：上海红益仪器仪表有限公司；交联葡聚糖Sephadex G－150层析柱：上海精科；SBS-100数控记滴自动部分收集器：上海康华生化仪器有限公司；LGJ-18冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司等。

2 方法

2.1 黄豆脲酶的提取

2.1.1 30%乙醇提取黄豆脲酶[1]

用天平称取干燥的黄豆，粉碎，以100目钢筛筛出豆粉。向锥形瓶中加入2.0g豆粉，再加入20mL的30%乙醇溶液，充分摇匀30 min，放置冰箱里保存24 h后，以3 000 r/min离心15 min，上清液为脲酶粗提取液。

2.1.2 70%甘油提取黄豆脲酶[2]

取25 g洗净晾干的黄豆，用无氨蒸馏水浸泡过夜，转入研钵中，加入少许70%甘油溶液研磨至糊状，用70%甘油稀释至250 mL，用玻璃棒搅拌混匀，静置提取后减压过滤，滤液盛于塑料瓶中，储于冰箱中待用。

2.1.3 32%丙酮提取黄豆脲酶

称取2 g黄豆粉置于三角瓶中，加入32%丙酮6 mL，振摇10 min，进行提取，然后倒入离心管中，用32%丙酮2 mL洗小三角烧瓶一次，洗液也倒入离心管中，离心（3 000 r/min）5 min，将上清液倒入刻度离心管中量取体积，加入等体积的冷丙酮，使蛋白质沉淀。进一步离心（3 000 r/min）5 min，弃去上清液。待沉淀中的丙酮蒸发后，加蒸馏水2.5 mL，使沉淀溶解。如有沉淀，再离心（2 000 r/min）5 min，取上清液，即为脲酶粗提取液。

2.2 黄豆脲酶的分离纯化

2.2.1 乙醇分级沉淀

向粗酶液中搅拌加入预冷（-10℃）的无水乙醇至终体积分数分别为10%、20%、30%和40%，再采用8 000 r/min冷冻离心10 min，收集上清液，测定酶活性。上清液继续搅拌加入预冷乙醇至终体积分数分别为40%和50%，15 000 r/min冷冻离心10 min，弃去上清液，收集沉淀，立即将沉淀溶于少量磷酸缓冲液（pH=6.8）中，4℃保存备用。

2.2.2 凝胶过滤

脲酶分子量较大，达293 500 u。脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G-150层析柱。酶本身不能进入凝胶颗粒，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。用磷酸缓冲液（pH=6.8）作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。

称取葡聚糖凝胶G—150 l g，置于三角烧瓶中，加水60 mL，于沸水浴中加热5 h（此为加热溶胀，如在室温溶胀需放置48 h～72 h）取出，待冷却至室温装柱。加样，控制流速7 d/min～8 d/min，流出的液体分别收集在刻度离心管中，收集量为3 mL/管，测定各管蛋白质含量，收集合并蛋白质含量较高的各管并测其酶活，4℃保存备用。

2.2.3 冷冻干燥

将经凝胶过滤后的酶液分装在玻璃皿，装量要均匀，蒸发表面尽量大而厚度要尽量薄一些，产品厚度不要超过1 cm[3]。

将装好的溶液速冻，温度在-35℃左右，时间约2.0 h。冻结后的样品须迅速进行真空升华干燥,料温控制在-20℃～-25℃之间，时间约为3 h～5 h。真空升华干燥后，样品中仍含有少部分的结合水，较牢固，所以必须提高温度，才能达到产品所要求的水分含量。控制料温由-20℃升到55℃，当料温与板层温度趋于一致时，结束干燥[4-5]。

真空干燥时间约为8 h～9 h，水分含量减至3%～5%左右，停止加热，减压，当仓内真空度恢复接近大气压时打开仓门，出仓，将已干燥的样品立即进行活性测定。

3 pH增值法测定黄豆脲酶活性[6]

将研细的试样与尿素缓冲液混合，尿素在尿素酶作用下水解产生氨，氨溶解于水溶液中使溶液pH升高，pH变化的程度与脲酶活性大小相关，因此可以用其与空白溶液的差值表示脲酶活性高低。

取0.200 g试样，装入比色管中，加入10 mL尿素缓冲液，迅速盖上盖子，剧烈摇动。将比色管置于（30±0.5）°C的恒温水浴锅中，准确保持30 min。另称取等量试样放入另一支比色管中，加入10 mL磷酸缓冲液，迅速盖上盖子，将试样与缓冲液混合均匀，置于水浴锅保持30 min，作为空白试验。每隔5 min将水浴锅中比色管中的试样摇匀一次。每个比色管保持30 min后，从水浴锅中取出，将上清液倒入小烧杯中。并在从水浴锅中取出恰好5 min时，用酸度计测出pH。

计算公式：UA=pH1-pH2

式中：UA为脲酶活性（ΔpH）；pH1为样品使尿素分解后样液的pH；pH2为空白样液的pH。

4 结果与分析

4.1 提取方法及粗酶液的添加量不同对黄豆脲酶活性的影响

通过对3种方法提取的脲酶粗酶液活性进行比较，结果见图1和图2。

图1 不同的提取方法对脲酶液酶活性的影响Fig.1 Effect of different extraction methods on the enzyme activity of soybean urease

图2 不同的添加量对脲酶酶活性的影响Fig.2 Effect of different addition amount on the enzyme activity of soybean urease

由图1和图2实验结果表明：无论活性测定时添加的粗酶液量多或少，采用32%丙酮提取出的粗酶液活性始终最差；采用30%乙醇和70%甘油提取出的粗酶液活性较高；对活性测定时的粗酶液添加量从0.2 mL进行至5倍、10倍的量的增加后，脲酶活性随之增高，即脲酶活性与测定时粗酶液浓度成正比；另外，同等添加量的粗脲酶液以70%甘油提取出的脲酶活性略高于以30%乙醇提取的脲酶活性考，虑到二者数值相差甚微，而甘油提取的操作较繁琐、所需试剂用量大，而乙醇提取则更为简便，故实验选用30%乙醇对黄豆脲酶进行提取。

4.2 乙醇分级沉淀过程中，不同终体积分数对脲酶活性的影响

4.2.1 黄豆粗酶液经一级沉淀（8 000 r/min）后，不同终体积分数的酶液活性

一级沉淀（8 000 r/min）后不同终体积分数的脲酶酶液活性，结果见图3。

图3 一级沉淀（8 000 r/min）后不同终体积分数的脲酶酶液Fig.3 Enzyme activity of soybean urease for different terminal volume after first-degree precipitation（8 000 r/min)

由图3可知，当加入预冷乙醇至终体积分数为10%时，收集到的上清液酶活性达到最高。当终体积分数到达40%时，随着酶被沉淀下来，上清液中酶活降低。故从以上四个体积分数梯度来看，冷冻乙醇一级沉淀终体积分数选择在10%时收集到的上清液酶活性最佳。

4.2.2 黄豆酶液经二级沉淀（15 000 r/min）后，不同终体积分数的酶液活性

二级沉淀（15 000 r/min）后不同终体积分数酶液活性对比结果见图4。

图4 二级沉淀（15 000 r/min）后不同终体积分数的脲酶酶液活性Fig.4 The enzyme activity of soybean urease for different terminal volume after second-degree precipitation（15 000 r/min）

由图4可知，经二级沉淀（15000r/min）后，终体积分数为40%时的酶液活性远远高于终体积分数为50%的酶液酶活。即终体积分数达到50%时沉淀中残留的酶很少，基本为0，故其酶活性很低。所以在冷冻乙醇的二级沉淀过程中，应使终体积分数为40%，以保留较多的酶。

4.3 黄豆脲酶在分级沉淀过程中的活性变化

大豆脲酶在各阶段酶液活性对比结果见图5。

图5 大豆脲酶在提取各阶段的酶液活性Fig.5 The enzyme activity of soybean urease at different extraction stages

由图5可看出，黄豆经30%乙醇溶液提取后得到的粗酶液活性在分级沉淀过程中最高。经过3 000 r/min离心15 min后的粗酶液中还残留有较多的豆壳、豆渣，而这些残留物中或多或少存在着部分脲酶，因此所测出的粗酶液活性也就相应的高，但杂质含量也高；经一级沉淀（8 000 r/min）后，黄豆酶液活性大大降低。可能是由于经过离心，此时上清液中的豆渣残留量大幅减少，同时加入的冷冻乙醇稀释了酶液的浓度，故测出的上清液酶活性偏低；经过二级沉淀（15 000 r/min）后，黄豆酶液活性比一级沉淀的略高。因为此时收集到的沉淀中脲酶的含量较高，且除去上清液后冷冻乙醇对酶活的影响甚微；虽然收集的脲酶沉淀中溶入了少量的磷酸缓冲液（pH=6.8），但因其量少对酶液浓度影响不大。

黄豆脲酶经过葡聚糖凝胶G-150过滤后，活性再次降低，约为0.12。造成该过程酶活偏低的原因可能是此阶段需加入大量磷酸缓冲液（pH=6.8）进行洗脱，因此所收集酶液中掺杂了大量的磷酸缓冲液，从而稀释了脲酶的浓度，故所测出的活性偏低。

经过冷冻干燥后，酶液中的磷酸缓冲液等水分得以去除，脲酶得到浓缩，纯度进一步提高，干黄豆脲酶的活性得到增加。

5 结论

本实验主要研究不同方法提取黄豆脲酶，并对所提取的脲酶进行分离纯化，同时测定其活性，以确定脲酶的最佳提取、分离、纯化方法。实验利用不同溶剂从干鲜黄豆中提取出黄豆脲酶，对脲酶的酶活进行测定，并进行分析比较。结果表明，从操作的简便性和所提取出酶液的活性等综合方面考虑，用30%乙醇溶液作为提取剂，要优于70%甘油和32%丙酮溶液。脲酶粗酶液加预冷乙醇至终体积分数为10%，以8 000 r/min冷冻离心10 min进行一级沉淀；再将上清液加预冷乙醇至终体积分数40%，15 000 r/min冷冻离心10 min进行二级沉淀；收集脲酶沉淀进行G－150凝胶过滤；最后将经过洗脱收集到的酶液进行冷冻干燥，即得到较纯且活性相对较高的脲酶。

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[1]周东凯,刘莹,马学良,等.大豆脲酶的提取及其影响因素研究[J].大豆科学,2008,27(4):704-707

[2]邹菁,喻德忠,杨先进,等.黄豆脲酶的提取及其在缓释肥料中尿素态氮测定中的应用[J].分析科学学报,2004,20(2):178-180

[3]邱玉华.生物分离与纯化技术[M].北京:化学工业出版社,2007:20-72

[4]郭勇.酶工程[M].北京:中国轻工业出版社,1994:50-89

[5]陈守文.酶工程[M].北京:科学出版社,2008:32-62

[6]杨奇慧,舒璐,钟剑锋.不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究[J].饲料广角,2008,21(21):30-32

Study on the Extraction and Enzyme Activity Determination of Urease from Soybean

LIN Li-yun，DONG Xiao-jie，CHEN A-wei
（Biology Department，Hanshan Normal University， Chaozhou 521000，Guangdong，China）

Abstract：Method of extraction and activity determination for the urease from soybean was investigated and the best method to gain highest activity urease was proposed as follows：dry soybean was extracted by 30%alcohol.The urease solution was separated by Sephadex G-150 column chromatography and concentrated by vacuum freezing dry.

Key words：soybean；urease；ethanol fractional precipitation；gel filtration；freeze dry

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.09.023

韩山师范学院青年基金项目（LQ200811）

林丽云（1982—），女（汉），实验师，硕士，主要从事生物资源高值利用。

2012-10-08