周 薇，海亚萍

（平凉医学高等专科学校，甘肃 平凉 744000）

骨髓间充质干细胞（MSCs）来源于中胚层，是具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞之一。在体外不同诱导条件下，可跨胚层向中胚层细胞如脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞等分化[1]。近年来研究发现，MSCs还可以分化为神经元、神经胶质细胞、肝细胞等[2]。MSCs易取材、免疫原性低、供体无明显并发症等特点，使其成为细胞治疗、基因治疗及组织器官再造的理想材料[3，4]。MSCs存在于人和动物的多种组织中，骨髓中的MSCs最易分离获得，但含量极低，约为 0.001%～0.010%[4，5]，因此，MSCs体外分离纯化、培养、扩增至足够数量是实验研究和临床应用的前提。本实验旨在探索MSCs体外分离纯化、培养、扩增、鉴定的方法，以获得大量、高纯度、高活性的MSCs，为MSCs的系列研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级3周龄Wistar大鼠（甘肃省中医学院实验动物中心提供），雌雄不限，体重 100～150g。

1.2 主要试剂

DMEM/F12（美国GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（Sigma公司），Percoll分离液（Pharmacia公司），转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、低分子肝素、青霉素、链霉素（Sigma公司），噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜 （DMSO，GIBCO 公司），CD29mAb-FITC、CD44mAb-FITC、CD34mAb-PE（BD公司）。

1.3 主要实验仪器

CO2培养箱（SANYO-IWCD-175型），超净工作台（SW-CJ-2FD），FACSAria型流式细胞仪（BD公司），倒置相差荧光显微镜（尼康公司）

1.4 方法

1.4.1 原代大鼠骨髓MSCs的分离、培养和传代 将大鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75%的酒精中15～20min，无菌条件下分离股骨、胫骨，PBS冲洗，去除骨两端，用DMEM/F12反复冲洗骨髓腔，经1ml注射器吸制成单细胞悬液，按1∶1比例将其加入到Percoll分离液中（1.083g/ml），以 2000r/min 离……