闫师杰 ，廉双秋 ，李晓丹 ，李 玲 ，朱文嫱，赵 越*

（1.天津农学院食品科学系，天津 300384；2.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；3.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv.Yali）是我国白梨品系的优良主栽品种，果实较耐贮藏，采用冷藏方法可以贮藏到第二年2～3月，鸭梨贮藏的主要问题是近果心部位组织褐变。闫师杰[1]研究认为，鸭梨果心较果肉过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性较低，维生素C及GSH含量下降较快，导致果心较果肉更容易积累自由基，发生脂质过氧化反应，最终导致膜透性升高，果心较早褐变。植物过氧化物酶（EC 1.11.1.7）的诱导蛋白质在植物防御期间发挥关键作用[2-3]。整个植物生命周期POD参与广泛的生理过程，可能是由于存在大量的同工酶和多功能酶催化反应[4]。一方面植物POD参与生长素代谢，木质素和木栓质形成，交联细胞壁成分，植保素的合成，它是一族能催化H2O2、氧化还原无机氢供体的酶[5-6]；另一方面与植物逆境胁迫诱导表达有关，例如：POD在病原菌的防御、冷冻、重金属离子、机械损伤等因子作用下诱导表达[7-10]，是植物抗氧化保护酶系的重要保护酶，是植物应对环境胁迫的生物标记之一[11]。目前已从数百种物种中克隆到POD基因，在GenBank登录的POD基因序列有1 000多个，而关于梨属的仅有2个片段，且是不完整的POD基因序列，鸭梨完整的POD基因序列及相关信息还未见报道。本研究根据已发表的梨属POD基因片段，利用RACE技术从鸭梨果实中克隆得到1个完整的POD基因cDNA。通过序列分析进一步揭示该酶的基因序列信息及表达特性，为最终调控植物体内过氧化物酶活性，抑制果实酶促褐变奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、载体和菌株

以采自河北省藁城的套袋鸭梨为试材，于2011年9月16日采摘，运回实验室，经梯度降温后放入冷库贮藏。在贮藏期间将鸭梨果实切成块状于液氮中速冻后-80℃保存备用。克隆载体pMD18-T Vector购于大连宝生物公司，大肠杆菌菌株E.coli DH5α感受态细胞购自北京天根生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂

M-MLV反转录试剂、DNA聚合酶、DNA纯化回收试剂盒（购自索莱宝公司）；限制性内切酶、T4DNA连接酶（购自大连宝生物公司）；质粒小量提取试剂盒（购自上海生工）；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（购自Clontech公司）；其他常规药品均为进口或国产分析纯试剂。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank上FJ478154.1公布的梨属POD基因的mRNA及CDS信息，用软件primer5.0设计引物POD-F、POD-R，经PCR扩增得到该基因的保守片段并测序，根据测序结果设计引物PODF1、PODF2用于cDNA的3'RACE扩增；设计引物PODR1、PODR2用于cDNA的5'RACE扩增；最后根据保守区、3'RACE、5'RACEcDNA序列的拼接结果，设计引物PODF3、PODR3用于POD基因cDNA全长扩增。

表1 PCR反应中使用的引物Table1 Primers in PCR

1.2.2 鸭梨POD基因cDNA全长的获得

鸭梨果实总RNA提取采用CTAB法提取[12]，反转录反应参照M-MLV反转录酶说明书，Oligo（dT）为引物合成cDNA第一链，以反转录cDNA为模板用引物对POD-F、POD-R进行扩增，扩增程序为：95℃预变性4 min，94℃变性35 s，60℃退火35 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸7 min。琼脂糖凝胶回收与预期目的片段大小一致的条带，电泳检测后连接克隆载体（pMD18-T Vector）并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选及质粒酶切鉴定阳性克隆后，送交测序。

根据克隆所得到的cDNA中间序列分别设计特异性引物PODF1、PODF2、PODR1和PODR2，按照RACE试剂盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit说明书操作，进行3'RACE和5'RACEcDNA末端快速扩增，将测序所得的中间序列及3'RACE和5'RACE序列进行拼接得到POD cDNA全长序列，再根据克隆所得全长序列设计引物PODF3和PODR3，以5'cDNA为模板，用于扩增POD cDNA全长，将该扩增产物回收并连入克隆载体后进行测序。

2 结果与分析

2.1 鸭梨POD基因的全长的cDNA的获得

根据鸭梨POD基因保守区设计引物POD-F、POD-R，以鸭梨果实cDNA为模板经PCR扩增及测序得到一个长度为445 bp的cDNA片段（见图1A）。依据所得中间序列设计特异性引物PODF1、PODF2、PODR1、PODR2，进行PCR扩增获得鸭梨POD基因的3'（见图1B）和5'（见图1C）cDNA末端序列，将测序后的中间片段及3'和5'末端序列拼接得全长1 487 bp的鸭梨POD基因序列。再根据该序列设计特异性扩增引物，经过PCR扩增后获得基因全长（见图1D）。将该基因提交GenBank，基因登录号为JQ325052。

图1 鸭梨PbPOD基因扩增电泳Fig.1 Electrophoresis pattern of PbPOD for Yalipear

2.2 鸭梨POD基因cDNA核苷酸序列分析

利用NCBI上提供的ORFFinder对该序列进行分析，发现鸭梨POD基因包含一个1 011 bp的编码区（CDS）；3'非翻译区长404 bp，含有典型的植物基因加尾信号序列Poly（A）；5'非翻译区长72 bp，起始密码子ATG后的第一个核苷酸为鸟苷酸（G），上述信息表明所克隆到的序列符合完整基因的结构特征，是一个完整的基因序列。

2.3 鸭梨过氧化物酶基因编码的蛋白质结构及功能位点分析

2.3.1 过氧化物酶基因编码的蛋白结构

ORFFinder分析表明，该基因的开放阅读框在73～1 083 bp区域，编码一个由336个氨基酸残基组成的多肽，推测分子质量大小为38.4 ku，等电点（pI，Isoelectric point）为8.54，原子总数为5 386，分子式为C1690H2691N487O499S19，不稳定系数为52.67，其为不稳定亲水性蛋白。

蛋白二级结构预测结果表明，PbPOD基因包含8个半胱氨酸形成4个二硫键，二级结构螺旋之间由环区和转角连接为主且占56.6%，α-螺旋占41.3%，β-折叠结构很少占2.1%。PbPOD与第Ⅲ类植物POD蛋白相比具有很强的结构类似性，可以初步判断鸭梨POD属于第Ⅲ类植物过氧化物酶超家族。通过同源建模法获得PbPOD的理论三维结构结果见图2（图2彩版见封二）。POD分子由两个不同的结构域组成，中间黄色部分为包埋着的血红素辅基，血红素平面上方远端的“空穴”是H2O2的作用位点，它还含有两个Ca2+结合区，一个Ca2+结合区位于近端结构域内，另一个位于远端结构域内，这在第III类POD中是高度保守的。

图2 PbPOD蛋白的三级立体结构预测Fig.2 Predicted tertiary structure of the PbPOD

2.3.2 POD蛋白的功能位点分析

通过NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）的保守域检索及立体结构预测工具Conserved Domain Database（CDD），发现POD蛋白具有两个保守功能域Cd00693（Secretory peroxidase，分泌性过氧化物酶）和Cl00196（Plant-peroxidaselike superfamily，植物过氧化物酶超家族）。进一步证明所获得基因就是鸭梨的过氧化物酶基因（见图3，图3彩版见封二）。

2.3.3 Pb-POD蛋白的分子进化关系分析

通过NCBI的BLAST数据库对PbPOD编码的蛋白序列进行比对，发现该蛋白序列与海榄雌（Avicennia marina）（BAB16317.1）POD有99%的相似性，与陆地棉（Gossypium hirsutum）POD（AAA99868.1）、木榄（Bruguiera gymnorhiza）POD（ADD54644.1）、油茶（Camellia oleifera）POD（ACT21094.1）、长春花（Catharanthus roseus）（AAY26520.1）、莲花（Nelumbo nucifera）（ABN46984.1）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）（CAB71128.2）有96%的相似性，与拟南芥（Arabidopsis thaliana）（CAA17163.1）、文心兰（Oncidium Gower Ramsey）（ABC02343.1）有95%的相似性，烟草（Nicotiana tabacum）（AAD33072.1）有93%的相似性，甜瓜（Cucumismelo subsp.Melo）（ADN34050.1）有92%的相似性，与多个物种POD基因所编码的蛋白序列相似性达90%以上，确定克隆得到的基因是与鸭梨褐变相关的POD基因。

图3 PbPOD基因编码的氨基酸序列的预测Fig.3 Predicted amino acid sequenceof PbPOD

为进一步阐明PbPOD与其他植物中POD蛋白之间的进化关系，使用Clustal X软件分析各POD蛋白序列之间的相似性，对包括PbPOD在内的植物POD蛋白进行聚类分析，使用MEGA5软件构建出一个分子进化树（见图4）。

图4结果显示，PbPOD与拟南芥的POD蛋白在进化关系上距离相对最近，表明它们可能是从同一祖先进化而来。

图4 鸭梨PbPOD与其他植物中POD之间的分子进化关系Fig.4 Phylogenetic evolution analysisbetween PbPOD in Yalipear and other plants

3 讨论与结论

本研究利用RT-PCR和RACE方法，从鸭梨果实中成功克隆出一条完整的过氧化物酶基因，该基因包含全长为1 011 bp的编码区，编码336个氨基酸。二级结构螺旋之间以环区和转角连接为主，其次是α-螺旋，β-折叠结构很少。蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。无规则卷曲结构可以决定蛋白质的功能，酶的功能部位常处于这种构象区域；而α-螺旋的主要功能是对蛋白质骨架起到稳定作用。本研究通过序列分析和氨基酸序列比对得到的结果，为进一步研究该酶的结构和生化特性奠定基础。

已有研究表明，POD基因与木栓质和木质素的合成有关，而POD酶被认为是抵抗病原侵入的重要防卫手段[13-15]。同时，研究表明在植物受到重金属、低温等条件的胁迫下，POD蛋白的表达量也随之显著增加[16-17]。但是，基因POD在病原菌防卫反应和植物抗逆反应中的作用还不完全清楚。因此，鸭梨POD基因的克隆为揭示POD结构与功能的关系提供较好的研究材料和基础，最终阐明其作用机理，为鸭梨采后酶促褐变的机理研究奠定重要的分子生物学基础。

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