陈秀华，王臻昱，李先平，朱延明，刘 丽，陈 威，陈 勤,6*

（1.云南省农业科学院粮食作物研究所，昆明 650205；2.云南田瑞种业有限公司，昆明 650205；3.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；4.中国科学院东北地理与生态研究所，哈尔滨 150081；5.云南省农业科学院经济作物研究所，昆明 650205；6.加拿大农业与农业食品部莱斯布里奇研究中心，加拿大 艾伯塔省 莱斯布里奇 T1J4B1）

植物谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferases，GSTs，EC 2.5.1.18）是一类普遍存在的，由一个庞大而复杂的基因家族所编码，具有多种生物学功能的一组同工酶。这类酶用于催化谷胱甘肽与有毒异源物或氧化产物结合，从而促进此类物质的代谢、区域化隔离或清除。根据序列相似性可将其分为三种类型（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）[1]，Ⅰ型包括具有除草剂解毒活性的GSTs，这类基因均包括3个外显子；Ⅲ型为植物激素诱导的GSTs，包括两个外显子；Ⅱ型有10个外显子，与哺乳动物的zeta GSTs相近。有学者建议将拟南芥中类似于哺乳动物theta GSTs划分为Ⅳ型[2]。另有将其分为八种亚类，其中 phi，tau，theta，zeta，lambda 和DHAR（Dehydroascorbate reductase，谷胱甘肽依赖的抗坏血酸还原酶）和TCHQD（Tetrachlorohydroquinone dehalogenase，四氯代氢醌脱卤素酶）亚类为可溶性GSTs，可溶性的植物谷胱甘肽还原酶也是本文主要探讨的内容。另一个亚类为微粒体的GSTs[3]，它和主要的GST超家族关系不大，但是具有相似的谷胱甘肽依赖的活性，在谷胱甘肽代谢中是一种膜关联蛋白。动物上也有theta和zeta相似结构的GSTs，其余结构均为植物所特有[4]。基因分析和植物基因组工程表明，GSTs由超过40种基因编码，而这些编码蛋白仅有10%的序列相似性[5]。大豆中有25个GSTs基因，玉米中有42个[5]，而拟南芥中有48个该基因家族成员，其中tau和phi最为丰富。GSTs对于细胞异源物质的清除，细胞解毒作用，以及提高植物对非生物胁迫的耐受具有重要作用。

1 GSTs的结构

可溶性GST是分子质量为50 ku二聚体疏水蛋白[4]，每个亚基大小为23～30 ku。目前，已了解结构信息的植物GSTs包括拟南芥phi和zeta亚类、小麦、水稻GST1（OsGSTU1）和玉米的tau亚类。

GSTs基因的序列相似性较低，但通过对大量GST蛋白晶体结构的研究发现GST蛋白结构具有高度保守性。每个亚单元包括两个不同的域，N末端和C末端是由一个α螺旋连接的分别为βαβ和ββα结构的不同基序。大部分胞液GSTs以同质或异质二聚体亚基形式发挥酶活性。植物中唯一有活性的GSTs单体是拟南芥lambda和DHARs[6]。对于phi和tau亚基来说，只有同一类型的亚基才能二聚化。在重组细菌中共表达GSTs亚基显示二聚体化是自发的，但这种自发性仅限同类亚基[7]。玉米tau GSTs ZmGSTⅤ和ZmGSTⅥ亚基形成异源二聚体和同源二聚体的可能性是相同的，然而phi GSTs ZmGSTⅠ和ZmGSTⅡ亚基更倾向于形成异源二聚体[7]。

X射线晶体衍射显示拟南芥和玉米的三个phi类GSTs有相似的三维拓扑结构，但却仅有20%的序列相同。每个亚基N末端域均有保守的结合谷胱甘肽的G位点，C末端的H位点为谷胱甘肽的结合提供一个高度保守的天冬氨酸残基和能够与疏水配体结合的大部分残基[8]。G位点是接纳GSH的特异部位，并且该位点能促成有催化活性的谷胱甘肽硫负离子形成。在三个phi GSTs中，活性部位位于两个亚基构成的大开口裂缝的其中一个侧面上，平面和球形的大分子可以通过，而且每个活性位点和邻近亚基有较轻微相互作用[9]。

2 GSTs的功能

2.1 解毒功能

GSTs最重要的一个功能就是失活有毒化合物的能力。异源物质在植物体内的代谢主要分为三个阶段：阶段Ⅰ（转化）、阶段Ⅱ（结合）和阶段Ⅲ（区域化）[10]。GSTs能催化谷胱甘肽中巯基基团对不同亲电分子进行亲核攻击，使外源性化合物与内源的还原谷胱甘肽（GSH）发生结合反应[11]。许多外源化学物在生物转化阶段I中极易形成某些生物活性中间产物，它们可与细胞生物大分子重要成分发生共价结合，对机体造成损害。谷胱甘肽与其结合后，可防止此种共价结合的发生。

2.2 跨膜运输定位

在植物中，很多次生代谢物对植物，甚至对产生它们的细胞都是有毒的。因此，将它们定位到合适部位（通常为液泡）很关键。谷胱甘肽泵能够识别与GSH结合而标记的内源底物和异源物质。在酶的作用下，ATP依赖的膜泵能够识别和转运轭合物跨膜排泄或隔离。花青素需要与GSH结合才能转运到液泡中[10]。色素在胞液中不当的滞留不但阻碍色素形成，而且会对细胞产生毒性[12]。

2.3 保护细胞免受氧化损失

羟自由基起始的氧化损伤内源产物具有很高的细胞毒性。包括膜脂过氧化物和DNA氧化降解产物等。GSTs使GSH和这种内源的亲电体结合已达到脱毒的作用。某些GSTs也作为谷胱甘肽过氧化物酶直接发挥脱毒作用[13]。

2.4 配体蛋白：非酶结合和胞内运输

GSTs还可能作为配体蛋白起作用。作为非底物配体的化合物，它们与GSTs绑定的位点与酶催化位点不同。植物中某些GSTs作为天然植物激素IAA的载体发挥作用。它们之间会形成植物激素结合蛋白而不是IAA-GSH共轭物。拟南芥GSTs Atpm24.1能够绑定光亲和的IAA类似物。但是这个酶却不能将GSH结合到IAA上，所以认为IAA类似物可能结合在距离活性中心较远的另一个结合位点上，结合方式与类固醇和卟啉衍生物类似[14]。这种非酶绑定可能允许IAA的临时储存和IAA活性、通过细胞膜的摄入和运输到受体的调控。GSTs配体蛋白的功能可能与预防分子在膜上或细胞内的过度积累导致的细胞毒性有关。

3 植物GSTs研究进展

GSTs不仅在正常细胞代谢和异质化合物的解毒方面均发挥着重要作用，对提高植物耐受不良环境条件、抵抗损伤等方面同样起重要作用。多种作物中的GSTs能够受到多种不同环境刺激诱导，如真菌攻击、干旱胁迫、乙烯和伤口等[1]。

大豆中GH2/4（也称为Gmhsp26-A）基因分别作为热激蛋白和植物激素诱导蛋白被独立克隆。通过分析这个蛋白与其他GSTs同源性和促使GSH和模式 底 物 CDNB（1-chloro-2，4-dinitrobenzene，1-氯-2，4-二硝基苯）发生结合的作用，确认它为GST。除热激和植物激素，包括ABA（Abscisic acid，脱落酸）、KT（Kinetin，激动素）、GA3（Gibberellic acid，赤霉素）、 PEG（Polyethylene glycol，聚乙二醇）、KCl、NaF和重金属等一系列化学物质均能诱导GH2/4信使[5]。

3.1 GST降低异源物质毒性研究

最早发现的植物GSTs的功能即为它能代谢除草剂转变为非毒形式。已发现几种主要的除草剂都能被GSH结合，而这种结合不会伤害目的酶。

高等植物中，还原型谷胱甘肽（GSH）和GSTs在降解某些异源物质中起到非常关键的作用。可溶性的GSTs介导GSH或其同系物与除草剂发生结合反应而引发其降解[15]。Xu等用乙草胺处理小米、高粱和玉米几种作物幼苗以诱导GSH和GSTs，当处理浓度不同时，硫醇含量和GSTs活性先随着处理浓度升高而升高，达到顶峰时开始下降，且这种趋势在这几种不同作物上的表现是相同的[16]。诱导的GST活性程度和硫醇含量与不同作物对乙草胺的抗性程度相关，因此推测内源的GSH库水平和GSTs活性与作物抵抗外源有毒物质的保护机制密切相关。May等也认为GSH的含量水平对植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫反应能力十分重要[17]，结合反应导致细胞内GSH含量突然降低。当体内GSH消耗过多时，胞质中GSH库含量的恢复速度可能影响植物抵抗胁迫的能力和对除草剂的耐受性[17]。

玉米GSTIV可以响应安全剂和一系列除草剂的胁迫。安全剂就是通过激活GST基因来加快植物体内除草剂代谢的[18]。

3.2 GSTs在植物非生物胁迫中的作用

先前的研究表明植物GSTs基因可以响应多种非生物胁迫，包括脱水、UV、冷害、干旱、高盐和ABA[19]。表明GSTs基因在植物抵抗非生物胁迫反应中发挥着重要作用。

3.2.1 低温

在烟草中超量表达一种同时编码谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性酶的cDNA，其GST和GPX活性均较野生型高出两倍。在寒冷胁迫条件下这些GST/GPX超量表达的烟草幼苗的生长速度显著高于对照。冷胁迫条件下，转基因烟草中氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量显著高于野生型，用GSSG处理野生型幼苗可加速其生长，而用还原型的谷胱甘肽或用其他巯基还原剂处理野生型幼苗则会抑制其生长。因此，超量表达GST/GPX可加速转基因烟草幼苗在冷胁迫条件下的生长，而这种现象可能是谷胱甘肽库中氧化型谷胱甘肽含量高造成的[20]。

Huang等从鳞翅目云杉蚜虫—云杉卷叶蛾中克隆得到一种谷胱甘肽S-转移酶基因，并将其转入模式植物拟南芥中[21]。分别将转基因拟南芥和野生型拟南芥置于4和10℃条件下48 h研究其对于低温的耐受作用。在4和10℃处理48 h后，检测到转基因拟南芥的GST活性分别高于野生型46.6%和35.7%，转基因拟南芥相对膜透性和丙二醛含量均高于野生型，而叶绿素含量和脯氨酸含量均低于野生型。转基因拟南芥在0℃处理24 h成活率为43.7%，而野生型成活率仅为28.3%。结果表明插入GST基因可增强转基因拟南芥的耐寒性。在水稻中表达盐地碱蓬的GST或共表达GST和CAT1（Catalase 1，过氧化氢酶1）基因，低温处理后，转基因植株的GST和CAT活性及PSⅡ最大光化学效率都比未转入这两种基因的对照高；细胞膜透性及H2O2和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量则低于对照。说明GST和GST+CAT1基因在转基因水稻幼苗的表达能够提高其对低温的抗性[22]。

3.2.2 干旱

植物生长和产量受到多种非生物胁迫因子的负向影响。George等应用耐干旱的葇荑牧豆树作为模式植物体系用于开发非生物胁迫耐受基因的功能[23]。用干旱胁迫2月龄的葇荑牧豆树的叶片建立cDNA文库，通过对该文库进行大规模的随机EST测序，鉴定出三个不同的由生长素诱导的谷胱甘肽转移酶。PjGSTU1是其中的一个定位于线粒体，并可提高转基因烟草干旱耐受能力的GST基因。在大肠杆菌中超量表达PjGSTU1，重组菌种PjGSTU1蛋白是由一个功能性的同源二聚体构成的，具有谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。转PjGSTU1基因烟草株系在15%PEG胁迫下较非转基因烟草生长良好。GFP融合技术表明PjGSTU1蛋白定位于转基因烟草的线粒体中。PjGSTU1的过氧化物酶活性和定位于线粒体说明该基因可能对于活性氧的清除起作用。

3.2.3 耐盐

存在于土壤和灌溉水中的渗透胁迫物质，离子毒性物质和高盐，特别是Na+和Cl-严重损害植物生长，盐害是作物减产的主要因素之一[24]。

Roxas等在烟草中超量表达一种同时编码GST和GPX活性酶的cDNA，在盐胁迫条件下这些GST/GPX超量表达的烟草幼苗的生长速度显著高于对照[20]。将克隆于盐地碱蓬中的谷胱甘肽转移酶基因转化拟南芥，通过对盐胁迫下野生型植株（WY）和T3代纯合子转基因拟南芥植株（GT）的生物量和谷胱甘肽（氧化型：GSSG；还原型：GSH）含量测量发现：转基因植株的生物量和GSSG含量在转基因品系中比野生型的含量均高。试验表明，GST基因的过量表达能够提高转基因植株在盐胁迫条件下的生长，这种结果也可能是通过氧化还原型谷胱甘肽来实现的[25]。

4 展望

植物对干旱、盐碱及低温耐性的强弱不只由某一个因子决定，其性状受众因子的共同影响。这种抵抗非生物胁迫复杂的机制加大了采用基因工程方法有效改良植物胁迫耐性的困难程度。通过分子育种导入或改良个别功能基因对提高植物抗逆性有限，难以满足生产需要，即使进行多基因的联合导入，各基因间的相互协调问题难以解决。深入了解GSTs基因功能和调控机制，将有助于抗逆转基因育种研究。

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