王桂玲， 房建强， 边书芹， 崔召娟， 赵雪梅

(泰山医学院，山东泰安 271000)

半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbataD.Don的干燥全草，别名通经草、并头草、牙刷草、韩信草等，味辛、苦，性寒，具有清热解毒、散瘀止血之功效。可以用于治疗癌症 (如肝癌、肺癌、乳腺癌、绒毛膜上皮癌等)，咽喉肿痛、疔疮肿毒、毒蛇咬伤、跌打损伤等症［1］。半枝莲作为常用的中药，含有多种化学成分，主要有黄酮类、二萜类、生物碱类、甾体类、酚类、多糖等［2-3］。目前，对半枝莲的研究大多数集中在黄酮类、多糖类等成分的提取、分离、纯化，药理作用方面［4-6］，而对半枝莲生物碱类成分有关这些方面的研究很少，本研究首先采用单因素试验结合Box-Behnken效应面法，以总生物碱提取量为指标进行试验，考察乙醇体积分数、提取时间、料液比、超声功率、提取次数等因素对提取工艺的影响，确定了最佳的提取工艺条件，然后采用纸片扩散法考察总生物碱提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌的抑菌作用。本研究可为最大限度开发半枝莲药理作用提供可靠的实验依据，同时也为进一步开发和临床合理利用半枝莲中生物碱类成分提供了参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津UV—2550紫外可见分光光度计 (岛津国际贸易上海有限公司);FDU-1200冷冻干燥机 (上海爱朗仪器有限公司);RE—52A型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);TMQ.R—3250自动台式灭菌器 (山东新华医疗器械股份有限公司);KQ—500DE数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);SW—CJ—2F超净工作台 (苏州净化设备有限公司);HHB11电热恒温培养箱 (天津市实验仪器厂)。

1.2 试药 半枝莲 (山东菏泽泰山中药饮片有限公司);盐酸小檗碱对照品 (上海同田生化技术有限公司，批号09030522，纯度98%);营养琼脂 (天津市英博生化世纪有限公司);药敏片 (氟哌酸、阿米卡星、氨苄青霉素等)(北京太洋药业有限公司);二甲基亚砜 (天津市凯通化学试剂有限公司);其它试剂均为分析纯。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌(由泰山医学院附属医院检验科提供)。

2 方法与结果

2.1 总生物碱定量测定［7-8］

2.1.1 标准品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品1.2 mg，用甲醇-盐酸 (100∶1)溶液溶解，定容到10 mL量瓶中，摇匀，配成质量浓度为0.12 mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液，保存，备用。

2.1.2 确定最大吸收波长 精密吸取2.1.1项盐酸小檗碱对照溶液0.2 mL，置于10 mL比色管中，加甲醇-盐酸(100∶1)溶液至8 mL，摇匀，在紫外分光光度仪上200～800 nm区间扫描，确定最大吸收波长为348 nm。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密吸取2.1.1项盐酸小檗碱对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于10 mL比色管中，分别加甲醇-盐酸 (100∶1)溶液至8 mL，摇匀，以甲醇-盐酸 (100∶1)溶液作空白，在348 nm处测定吸光度，为减少操作误差平行测定3次，求平均值。得回归方程:A=69.867C+0.022，R2=0.998 6，表明在0.001 5～0.007 5 mg/mL线性关系良好。

2.2 总生物碱提取工艺的优化

2.2.1 单因素试验 分别选取乙醇体积分数、提取时间、料液比、超声功率、提取次数5个因素研究其对总生物碱提取量的影响。

2.2.1.1 乙醇体积分数对总生物碱提取量的影响 称取半枝莲5份，每份1 g，分别用30倍体积的45%、55%、65%、75%、85%的乙醇，70℃，250 W功率，回流提取30 min，提取1次，得到的提取液分别用相应体积分数的乙醇定容到100 mL量瓶中，再分别用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-盐酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm测定。结果见图1。从图中可以看出随着乙醇体积分数的提高，总生物碱提取量也随之增加，但乙醇体积分数到达55%时出现最高点，此后随着乙醇体积分数增加，总生物碱提取量呈下降趋势。说明半枝莲中生物碱类成分的极性较大。所以选择55%乙醇作为提取的适宜溶剂。

图1 乙醇体积分数对总生物碱提取量的影响

2.2.1.2 提取时间对总生物碱提取量的影响 称取半枝莲5份，每份1 g，70℃，250 W功率，采用30倍体积55%乙醇分别提取20、30、40、50、60 min，提取1次。得到的提取液分别用55%乙醇定容到100 mL量瓶中，再分别用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-盐酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm测定。结果见图2，从图中可以看出，随着时间的延长，总生物碱提取量逐渐增加，当提取时间为50 min时出现一个小高峰，此后提取量略有下降，所以选择提取时间以50 min为宜。

图2 提取时间对总生物碱提取量的影响

2.2.1.3 料液比对总生物碱提取量的影响 称取半枝莲5份，每份1 g，70℃，250 W功率，采用55%乙醇，料液比分别为 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，回流提取 50 min，得到的提取液分别用55%乙醇定容到100 mL量瓶中，再分别用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-盐酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm测定。结果见图3，从图中可以看出，随着料液比的增加，总生物碱提取量也随之增加，这是因为溶剂增多则有更多的生物碱溶解于醇中，但料液比达1∶50时出现最高点，此后提取量略呈下降趋势，所以选择料液比1∶50左右为宜。

图3 料液比对总生物碱提取量的影响

2.2.1.4 超声功率对总生物碱提取量的影响 称取半枝莲5份，每份1 g，70℃，料液比1∶50，分别采用250、300、350、400、450 W的功率，回流提取50 min，得到的提取液分别用55%乙醇定容到100 mL量瓶中，再分别用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-盐酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm测定。结果见图4，从图中可以看出，随着功率的增加，总生物碱提取量先随之下降，然后随之升高，但功率达350 W时出现一个小高峰，此后随着功率继续增加，提取量呈下降趋势，故功率选择350 W为宜。

图4 超声功率对总生物碱提取量的影响

2.2.1.5 提取次数对总生物碱提取量的影响 称取半枝莲5份，每份1 g，70℃，料液比1∶50，功率为350 W，回流提取50 min，分别提取1次、2次、3次。得到的提取液分别用55%乙醇定容到100 mL量瓶中，再分别用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-盐酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm测定。结果见图5，从图中可以看出，随着提取次数的增加，提取量逐渐增加，提取次数为由2次到3次时，总生物碱提取量增加的幅度不大，说明总生物碱已提取完全。所以从节省能源，降低成本考虑，提取次数选2次为宜。

图5 提取次数对总生物碱提取量的影响

2.2.2 Box-Behnken效应面法优化总生物碱提取工艺

2.2.2.1 实验设计及结果 根据Design-Expert 8.05b软件中Box-Behnken设计原理，综合单因素试验结果，选取乙醇体积分数、提取时间和料液比对总生物碱提取量有显著影响的3个因素，每因素设3水平，用代码－1、0、+1表示，代码值所代表的物理量见表1，实验设计及结果见表2。

表1 因素水平

表2 实验设计及结果

2.2.2.2 模型的建立 用ANOVA分析效应面的回归参数，分析结果见表3。由表3可知，乙醇体积分数、提取时间1次项、乙醇体积分数、提取时间2次项达到极显著水平(P＜0.01)，乙醇体积分数和提取时间交互作用达到显著水平 (P＜0.05)。Design-Expert 8.05b软件对表2数据进行多元回归拟合，得总生物碱提取量对乙醇体积分数 (A)、提取时间 (B)、料液比 (C)的2次回归模型:Y=13.25－0.9A+1.65B－0.2C+0.81AB+0.25AC+0.3BC－1.35A2－1.25B2－0.14C2，该方程的相关系数R2=0.949 5。再由表3可知，整体模型达到极显著水平 (P＜0.01)，表明该二次方程模型比较显著，失拟项不显著 (P=0.050 2)。该方程对试验拟合较好，可以对不同条件下的总生物碱提取量进行预测。

表3 回归分析结果

2.2.2.3 提取工艺的响应面分析及优化 采用Design-Expert8.05b软件，根据回归方程分析结果，作出相应的响应面图，见图6～8。图6显示，料液比为1∶50的条件下，乙醇体积分数与提取时间对总生物碱提取量的影响，乙醇体积分数和提取时间的影响基本呈二次关系，总生物碱提取量随着提取时间增加逐渐增加，当乙醇体积分数为52%左右时，总生物碱提取量达到最大值。

图6 提取时间与乙醇体积分数对总生物碱提取量影响的响应面

图7显示，提取时间为50 min条件下，乙醇体积分数与料液比对总生物碱提取量的影响，料液比基本上对总生物碱提取量影响不大，乙醇体积分数对总生物碱提取量的影响呈二次关系，呈现出先增加后降低的趋势。

图7 料液比与乙醇体积分数对总生物碱提取量影响的响应面

图8显示，乙醇体积分数为55%的条件下，提取时间与料液比对总生物碱提取量的影响，提取时间影响基本呈二次关系，提取时间在58 min左右时，总生物碱提取量达到最大值。

图8 提取时间与料液比对总生物碱提取量影响的响应面

2.2.2.4 总生物碱提取的工艺条件 根据模型的分析结果，结合对总生物碱提取量有影响的各因素变化的响应面图，确定总生物碱提取的最佳工艺条件为:乙醇体积分数为52.17%，提取时间为58.51 min，料液比为1∶45.87，在此条件下总生物碱理论提取量为13.829 7 mg。

2.2.2.5 验证试验 在此最佳工艺条件下进行提取总生物碱平均提取量为13.306 5 mg，与理论提取量接近，说明该模型可靠。

2.3 总生物碱抑菌实验研究

2.3.1 总生物碱溶液的制备 称取半枝莲50 g，按最佳工艺条件进行提取，提取液回收乙醇后用1/2体积的石油醚萃取2次，萃取后冻干，制成总生物碱粗粉。称取总生物碱粗粉142.5 mg(相当于生物碱12.6 mg)，用700 μL的DMSO溶解，制成质量浓度为18.0 mg/mL的溶液，备用。

2.3.2 纸片扩散法测定总生物碱的抑菌作用 将定性滤纸用打孔器打成直径为6 mm的纸片，高压灭菌后烘干。然后将滤纸片用无菌镊子夹取放入总生物碱粗提物溶液中浸泡，用涂抹法将各供试菌液 (菌液浓度约为107～108cfu/mL)接种在培养基上，再用无菌镊子夹取沾有总生物碱溶液的滤纸片放入培养皿中，药敏片做阳性对照，DMSO浸润的滤纸片作阴性对照［9-10］。然后放入37℃的培养箱中培养24 h，测量抑菌圈的直径，并记录测量数据，每组实验重复3次。判断标准:抑菌圈直径大于6 mm者判为有抑菌作用;抑菌圈直径小于或等于6 mm者判为无抑菌作用;3次重复试验均达到有抑菌作用结果者判为合格。阴性对照组应无抑菌圈产生，否则实验无效。结果见表4、5及图9所示，从表4、5数据及图9可以看出，半枝莲总生物碱粗提物质量浓度为18.0 mg/mL时对金黄色葡萄球菌无论是标准株还是耐药株都有一定的抑菌作用，属于中度敏感，但对大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌没用抑菌作用。

表4 半枝莲总生物碱的抑菌作用

表5 半枝莲总生物碱抑菌定性实验结果

图9 总生物碱粗提物抑制金黄色葡萄球菌的效果照片

3 讨论

3.1 在中药提取、制剂工艺筛选过程中，常常需同时考察多个因素对结果的影响，并对结果进行优化确定最佳条件。国内现在用得比较成熟的方法有正交试验设计和均匀设计，这两种设计方法试验次数较少，操作简便，但不能灵敏地考察各因素之间的交互作用。Box-Behnken效应面法是一种新型的试验设计方法，能在给出的区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值，并且能研究几种因素间交互作用的分析方法，具有试验次数少，精度高等优点，在国内外药学领域已经得到了广泛的应用［11-13］。

3.2 本研究曾采用酸水超声提取半枝莲中生物碱类成分［14］，通过与乙醇提取进行比较，发现酸水超声提取的生物碱量虽然较高，但同时会提取出一些水溶性的杂质如蛋白质、多糖等成分，这些杂质会使后续处理如碱化、过滤等环节变得繁琐，另外酸、碱还会对仪器设备产生腐蚀，所以采用乙醇超声提取半枝莲中的生物碱。

3.3 本研究以总生物碱提取量为指标，在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken效应面法确定了半枝莲总生物碱提取的最佳的工艺参数，总生物碱提取的最佳工艺条件为加45.87倍52.17%的乙醇，提取2次，每次为58.51 min，此最佳工艺条件下进行验证试验，验证试验总生物碱平均提取量为13.306 5 mg，与理论值接近，说明Box-Behnken效应面法应用在中药提取工艺筛选的可行性。

3.4 通过对总生物碱粗提物进行体外抑菌作用研究，表明质量浓度为18.0 mg/mL半枝莲总生物碱对金黄色葡萄球菌无论是标准株还是耐药株都有一定的抑菌作用，但对大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌没用抑菌作用。通过研究发现总生物碱主要抑菌对象是革兰氏阳性菌，特别是对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强，因此，推测总生物碱的抑菌成分作用部位可能在细菌的细胞壁上，但具体的作用机制还有待进一步研究。

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