余 华，熊浚智，何晓梅，盛哈蕾，蔡文强，谢 玮，张克斌

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa，Pa）又称绿脓杆菌，是临床最常见的条件致病菌，具高度的环境适应力和耐药性。在烧伤、创伤、免疫缺陷、器官移植、肺囊性纤维化及一些医院感染病人中引起严重感染。Pa弹性蛋白酶（elastase，LasB）由lasB基因编码［1］，是其最主要的分泌型蛋白酶及毒力因子，与其致病性密切相关。目前对弹性蛋白酶在该菌侵袭力和致病性中的作用有一些研究［2］，但尚欠系统和深入。如果能获得无弹性蛋白酶活性的Pa菌株，将为更全面深入研究弹性蛋白酶在Pa中的致病机理，以及细菌与宿主相互关系等方面提供材料和基础。

近年来发展起来的利用λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统，具有重组效率高、所需同源序列短、可定点进行基因敲除、敲入、点突变等操作的特点［3］。目前，Red重组酶系统已广泛应用于大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌等细菌的基因修饰中［4－5］，但现有的Red重组酶质粒（如p KD46）所具有的温敏性复制子oriR101和rep A不能在Pa中进行复制，从而极大地限制了其在Pa基因修饰中的运用。然而含有p RO1610复制子的p UCP系列质粒，可在Pa、大肠杆菌及多种革兰氏阴性菌中稳定复制［6］。为此，本研究通过构建含有Red重组酶基因的穿梭质粒p UCP－Red，采用双臂同源重组法以获取敲除lasB基因的Pa菌株。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒 大肠杆菌DH5α、Pa野生株（PAO1）为本室保存。质粒pJQ200SK由第三军医大学微生物教研室李明博士惠赠；p KD46、p MD18T和p UCP载体为本室保存。1.2 主要试剂和仪器 DNA限制性核酸内切酶购于Ta KaRa公司；……