吕 恒，张锦海，顾海涛，王 平，王长军，王玉邦

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)主要包括 O157∶H7、O26∶H11、O111和O104等几种血清型，其中O157∶H7是典型菌株［1］。该病原菌可引起人腹泻、出血性肠炎、血栓性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒症。EHEC O157∶H7的感染具有暴发流行、强致病性、高致死率以及抗生素治疗可能加剧病情等特点［2］。因此快速、特异的检测对于该病的早期诊断及疫情的有效控制至关重要。目前我国EHEC的检测方法有显性培养基分离法、免疫磁珠富集、血清凝集等方法。但这些方法存在费时费力、检测时限长等弊端［3］。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是 Notomi等［4］建立的一种核酸等温扩增技术，能在等温条件下高效、快速、灵敏、特异地扩增靶基因。该方法具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势，可广泛用于病毒病、细菌病、寄生虫病的诊断［5-7］。本研究以 EHEC O157∶H7的编码脂多糖rfbE基因为靶序列设计引物，建立了优化的LAMP检测技术，并在此基础上应用金属离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue，HNB)判定反应结果，使LAMP的结果判断更简单直观，可为基层医疗机构、疫情现场调查提供快速可视化的检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 Loopamp DNA扩增试剂盒、Loopamp LA-320C实时浊度仪(北京蓝谱公司)，羟基萘酚蓝(HNB)(Sigma公司)，细菌基因组DNA抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA 250bp marker等(大连宝生物公司)，Eppendorf 5415R离心机(德国Eppendorf公司)，BIO-RAD电泳仪(美国Bio-Rod公司)，紫外分光光度计(美国 Thermo Fisher公司)。

1.2 菌株 EHEC O157∶H7，肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、宋内志贺菌菌株均由军事医学科学院馈赠；……