郭 娜，郭英华，苏龙翔，王雅娟，刘 岩，姜学革，刘长庭

中国人民解放军总医院南楼呼吸科，北京 100853

肺动脉高压是一种临床常见病症，病因复杂、治疗困难、预后差，严重威胁着患者健康，影响患者生活质量。低氧引起血管内皮细胞损伤，血管内皮合成和分泌的各种血管舒缩因子平衡失调导致早期肺血管收缩和后期的肺血管重塑，是导致肺动脉高压的一个重要机制［1］。因此，提高肺血管内皮细胞对缺氧耐受性、增加损伤后存活率、改善其功能，是防止缺氧导致的肺动脉高压发生和发展的关键问题。近年研究发现，肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor，HGF)是一种特异的促内皮细胞生长因子，能提高细胞生物学功能及对抗致病因素损伤［2-3］。有研究表明，HGF具有强大的促血管生成作用，在肺的形成和肺结构损伤修复过程中发挥着重要作用。在利用腹腔注射野百合碱构建的大鼠肺动脉高压模型中，HGF能靶向作用于肺小动脉并阻止肺动脉高压进展，当肺动脉高压引起肺血管损伤时，肺内HGF mRNA水平和蛋白浓度下降，而血浆中HGF的水平在第4、第7和第14天代偿性升高［4-5］，可见HGF对于保护肺血管是必须的。虽然目前已有研究均表明HGF对于血管内皮细胞具有保护作用，但在肺微血管内皮缺氧损伤方面尚未有实验证实。本研究通过HGF作用于缺氧损伤的人肺微血管内皮细胞 (human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs)后，观察损伤后HPMECs的存活率、体外培养时细胞的贴壁能力，检测细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表达的改变，旨在为探索缺血性肺动脉高压的发病机制及药物治疗提供实验依据。

材料和方法

主要材料和试剂 HPMECs细胞株购自美国Sciencell公司，ECM培养基购自美国GIBCO公司，澳洲胎牛血清购自瑞士Lonza公司，胰酶购自美国Sciencell公司，人重组肝细胞生长因子 (rhHGF)购自美国Peprotechasia公司，PHA665752购自美国Selleck公司，兔抗人vWF抗体购自美国Santa Cruz公司，FITC标记山羊抗兔IgG、ICAM-1抗体和二抗兔抗小鼠抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，二氧化碳培养箱购自三洋公司。

HPMECs体外培养 HPMECs接种于25 cm2培养瓶中，用ECM培养基培养细胞，500 ml ECM培养基中添加青霉素/链霉素5000 U，胎牛血清50 ml。每2～3d换液1次，待细胞生长至80%融合时用胰酶消化法，按1∶2(体积比)分瓶传代，用第6～8代细胞进行实验。将HPMECs接种在2.55 cm×2.15 cm大小的盖玻片上，爬片24 h后，换细胞培养液1次，待其生长至30%融合时进行实验。HPMECs在37℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。

HPMECs的鉴定 将第7代HPMECs接种在2.55 cm×2.15 cm大小的盖玻片上，待其生长至30%融合时取出盖玻片，PBS漂洗3次，每次5 min，4%(体积分数)多聚甲醛固定30 min后再以PBS漂洗 (方法如前)，随后用0.2%(体积分数)TritonX-100通透细胞2 min并用山羊血清封闭20 min后，加入兔抗人vWF(体积比1∶50)，室温下一抗孵育2 h后4℃过夜。次日用PBS漂洗3次，加入FITC标记的二抗 (体积比1∶50)室温下孵育1 h，最后用甘油封片，荧光显微镜下观察并拍照。

构建缺氧损伤模型 按实验分组处理细胞并待细胞贴壁后，将细胞放入特制容器中，容器外接两根管道，其中一根管道进气，另一根管道出气，向进气口中持续通入含5%CO2、0～5%(体积分数)O2的混合气体，并将出气口通入水中防止外界O2进入容器中，容器其他部位均密封。将容器放入水浴锅中，调节水浴锅温度，实时监测容器中实际温度，保证容器中温度为 (37±2)℃。

rhHGF对HPMECs存活率的影响 选择4～7代细胞，胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，以2×103个/孔的密度接种于96孔板上，次日换无血清培养基培养24 h，随后按实验设计分4组:第1组为空白对照组，细胞于37℃、5%CO2、常规O2培养;第2组为阴性对照组，细胞于37℃、5%CO2，0～5%O2下培养;第3组为HGF组，向细胞培养基中加入不同质量浓度的 HGF(10、30、50、80、100μg/L)，将细胞于37℃、5%CO2，0～5%O2下培养;第4组为PHA组 (HGF阻断剂组)，向细胞培养基中加入浓度为5 μmol/L的HGF阻断剂PHA665752，将细胞于37℃、5%CO2，0～5%O2下培养。24 h后向各实验组中加入 MTT溶液 (质量浓度 5 g/L)20 μl，37℃下孵育4 h后吸除上清液，每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min使结晶充分溶解。在酶标仪上以490 nm波长测定各孔光密度 (D)值。存活率=(D实验组－D空白对照组)/D空白对照组×100%。每组设 3 个复孔，重复3次。

rhHGF对HPMECs体外培养贴壁能力的影响选择4～7代细胞，胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×104个/ml，将细胞悬液500 μl接种在24孔板中，按实验分组，分别设立空白对照组、阴性对照组、HGF组 (50μg/L)和 PHA665752(5 μmol/L)组。37℃、5%CO2培养1 h后弃去上清液，随机选取3个高倍镜视野 (200倍)计数贴壁细胞，每个组各设3个复孔。

rhHGF对HPMECs表达ICAM-1的影响 选择4～7代细胞，将细胞培养在25 cm2培养瓶中，待细胞贴壁生长至80%融合后，更换无血清培养基，每瓶3 ml，饥饿培养24 h后，按实验分组处理细胞，分别设立空白对照组、缺氧损伤组、HGF组 (50μg/L)和PHA665752(5 μmol/L)组，向培养瓶中加入等体积 (4 ml/瓶)的添加干预成分的细胞培养基，待培养24 h后按照RIPA法提取蛋白，随后采用Western blot法检测ICAM-1的表达。采用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)电泳、转膜、免疫化学发光，拍照，Quantity one软件进行条带灰度分析。

统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用ANOVA检验，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

HPMECs的体外培养和鉴定 体外HPMECs能稳定传代，细胞传代时经胰蛋白酶消化后成圆球形，吹打后可从培养瓶壁上脱落，12 h后细胞可贴壁，细胞形态学特征见图1～2。

图1 人肺微血管内皮细胞在普通光学显微镜下成像 (×100)Fig 1 Normal human pulmonary microvascular endothelial cells under the ordinary optical microscope(×100)

图2 人肺微血管内皮细胞经FITC-vWF染色后，同一视野荧光显微镜下成像 (×100)Fig 2 The fluorescent microscopy of human pulmonary microvascular endothelial cells after stained with fluorescein isothiocyanate conjugated rabbit anti-vWF antibody(×100)

构建缺氧损伤模型 所构建缺氧损伤模型，保证除氧气体积分数以外的其他条件 (CO2体积分数、温度、湿度等)与空白对照组一致。

细胞存活率检测结果 10、30、50、80、100μg/L HGF组的细胞存活率分别为0.528±0.029、0.521±0.021、0.518±0.021、0.518±0.021、0.513±0.019，均明显高于缺氧损伤组的－0.171±0.032(P均＜0.01)，但各HGF浓度组间差异均无统计学意义 (P均＞0.05);当用HGF阻断剂PHA665752(5 μmol/L)干预后，其细胞存活率为－0.274±0.050，明显低于缺氧损伤组和各HGF浓度组 (P均＜0.01)。

HPMECs贴壁率的测定结果 按实验分组处理细胞后，随机选取3个高倍镜视野计数贴壁细胞，结果显示缺氧损伤组细胞贴壁率为7.111±2.369，明显低于50μg/L HGF组的17.111±3.790(P ＜0.001)，明显高于PHA组的2.556±1.944(P＜0.001)，与空白对照组的8.667±2.121差异无统计学意义 (P＞0.05)。

ICAM-1表达的测定结果 按实验分组处理细胞后，提取蛋白，检测ICAM-1的表达，结果显示缺氧损伤组、50μg/L HGF组和PHA组的ICAM-1表达量分为1.141±0.072、1.123±0.134和1.267±0.248，均明显高于空白对照组的0.671±0.119(P均 ＜0.01)，50μg/L HGF组和 PHA 组的 ICAM-1表达量均明显低于缺氧损伤组 (P均＜0.01)。

讨 论

目前，肺动脉高压的治疗虽然取得较大进展，但是病死率仍然很高，而且并不能达到完全治愈的目的。肺移植术虽然可达到根治目的，但基于其移植供体不易获得、排异反应以及费用高等缺陷，仅能有少数患者获益。因此，无论是对于临床工作还是科学研究，开发有效的治疗药物都是必须的。

HGF又称扩散因子，是由相对分子质量为69×103的α亚基和34×103的β亚基通过二硫键组成的有活性的异源二聚体［6］，细胞膜表面的 c-Met蛋白是HGF的特异性受体，PHA665752是c-Met受体抑制剂，可以抑制其生物学作用［7］。有研究表明，HGF通过与c-Met受体结合，催化底物蛋白的磷酸化，将细胞外的信息转导到细胞内部，构成HGF/c-Met信号转导途径，发挥生物学效应。目前研究发现，HGF可以刺激多种不同类型的细胞发生生物学效应，主要包括:促进牛视网膜血管内皮细胞增生和移行［8］、促进人脐静脉内皮细胞的增殖和毛细血管形成［9-11］、促进脐静脉内皮细胞合成NO从而增强内皮细胞的活力［12］、促进干细胞的定向移动并诱导其分化为血管内皮细胞［13］。本研究采用HGF作用于缺氧损伤的HPMECs，观察损伤后HPMECs存活率、体外培养时细胞的贴壁能力及检测ICAM-1表达的改变，以期从细胞水平进一步探讨HGF对缺氧损伤HPMECs的保护作用，为探索缺血性肺动脉高压的发病机制和药物治疗提供实验依据。

血管内皮的完整性不仅依赖于减少细胞死亡，更重要的在于保持血管内皮细胞增殖与细胞死亡的动态平衡，因此，有效提高内皮细胞的存活率有利于损伤内皮修复。研究表明，HGF可促进脐静脉血管内皮细胞增殖［9］，同时在HGF作用下，肺癌细胞A549形成的病灶具有明显的毛细血管诱生作用［10］。本研究中，HGF可以显著提高缺氧损伤HPMECs的存活率，当用HGF特异性受体阻断剂PHA665752阻断HGF作用后，细胞存活率较HGF干预组和缺氧损伤组显著下降，可见HGF是有效的促进HPMECs增殖的细胞因子，对于缺氧损伤后HPMECs起到保护作用，提高了损伤后HPMECs存活率，同时，一旦HGF通路被抑制后，细胞不仅不能正常增殖，其损伤程度将进一步加重，存活率较单纯损伤组显著下降。

以往大量研究发现，细胞培养过程中，细胞状态良好时，细胞贴壁的效率高，细胞贴壁后形态更加规则，细胞与细胞之间的差异性更小。国内外学者运用体外差速贴壁法来分离纯化细胞，细胞的贴壁速度与物理性状和成熟度密切相关［14］。本研究发现，在缺氧损伤时HPMECs贴壁能力较空白对照组有所下降;HGF干预后，HPMECs的贴壁能力较缺氧损伤组明显增强;用特异性阻断剂PHA665752阻断HGF的作用后，HPMECs贴壁能力明显下降。由此可见，HGF使HPMECs处于良好的生长状态下，为细胞生长提供了适宜的微环境，内皮细胞本身也可以分泌少许的HGF，当阻断HGF通路后，细胞贴壁率下降，细胞的生长状态受到影响。HGF对于保证HPMECs正常生长是必须的，并且在给予外源性HGF后其贴壁率较正常对照组升高。

ICAM-1是一种免疫球蛋白超家族类的细胞表面黏附分子，基因定位于19号染色体上，在血管内皮细胞上表达最强，是活化血管内皮细胞表达的重要黏附分子［15］。ICAM-1是炎症反应的可信标志物［16］，在细胞表面的表达量可反映损伤病变的严重程度［17］。同时，ICAM-1作为重要炎性介质在肺部炎症反应中起重要作用，其表达水平与肺损伤程度密切相关［18］。已有研究表明，ICAM-1促进多型核白细胞在肺内聚集并刺激其释放弹性蛋白酶和其他水解酶，加重肺组织损伤［19］，因此，通过下调ICAM-1的表达水平来减轻肺损伤是一种行之有效的方法。本研究结果显示，正常HPMECs有少量ICAM-1表达，缺氧损伤时ICAM-1的表达量较空白对照组明显升高，HGF可抑制ICAM-1表达，当HGF作用被阻断后，ICAM-1表达升高，说明HGF可以抑制HPMECs表面炎症介质表达，抑制损伤发生。

综上，本研究从细胞水平探讨了HGF对缺氧损伤HPMECs的保护作用，缺氧损伤过程中，炎症反应标志物ICAM-1被激活，引起HPMECs结构和功能的损伤，使细胞增殖能力受损，贴壁能力下降。HGF通过抗炎症因子作用 (包括减少ICAM-1的表达)而增加了HPMECs存活率，提高体外培养时细胞的贴壁率，从而减轻缺氧损伤所造成的HPMECs损伤，对肺动脉高压的防治发挥了重要的作用。

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