康永安，胡燕荣，高 莉，杨 海，李南方

新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心 新疆高血压研究所，乌鲁木齐 830001

GIRK4是G-蛋白偶联的内向整流型钾离子通道(G-protein gated inward rectifier K+channel，GIRK)家族成员之一，由KCNJ5基因编码，GIRK基因异常表达和许多临床疾病的发生发展密切相关［1］，其作为GIRK家族成员在机体内的病理生理作用日益受到人们的重视。目前研究已初步表明，GIRK4基因异常表达可能与心房纤颤［2］、肥胖及代谢综合征［3］等疾病相关。最近Choi等［4］研究表明，GIRK4基因遗传变异可能与肾上腺腺瘤异常增生分泌过多醛固酮引起继发性高血压相关。GIRK4基因可能为代谢性疾病及循环系统疾病的候选基因之一，而肾脏在机体内具有重要的内分泌及代谢功能，并参与肾素及促红细胞生成素的分泌，在调节水盐代谢平衡及胰岛素代谢中具有重要的作用，因而在血压调节及物质代谢过程中发挥重要作用。本研究观察了GIRK4基因在正常与肥胖大鼠肾脏组织中表达差异，以期为研究肾脏GIRK4表达对机体物质与能量代谢及血压水平等方面的影响提供理论依据。

材料和方法

实验动物与饲料 选取同种系4周龄体形相近的健康SD大鼠30只，随机分为实验组和对照组，其中实验组20只，对照组10只，均雌雄各半。SD大鼠购自新疆医科大学动物实验中心，由固定培训合格人员进行饲养及管理。高脂高糖饮食配方:基础饲料60%，蛋黄粉5%，猪油10%，花生5%，大豆粉5%，白糖5%，全脂奶粉8%，食盐2%。

主要试剂 RIPA试剂盒、BCA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，GIRK4一抗 (兔抗大鼠单克隆抗体)、内参 (小鼠抗GADPH单克隆抗体)、GIRK4二抗 (辣根酶标记山羊抗兔IgG)、甘油醛-3磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH)抗体 (辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)试剂盒为 Pierce公司产品，显影液、定影液为天津化工产品，彩虹预染的蛋白Marker(相对分子质量为12000～80000)为proteinrulerTMTransGen Biotech产品，葡萄糖试剂盒、三酰甘油试剂盒、胆固醇试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。

主要仪器设备 －80℃超低温冰箱 (三洋，日本)，超纯水仪 (EASYPUE，美国)，加样器 (Distriman，吉尔森公司)，垂直电泳仪 (Bio RAD，美国)，低温高速离心机 (BIOFUGEPLCO，德国贺力士)，半干式转移电泳仪 (大连竞迈生物科技有限公司)，凝胶成像分析仪 (Bio RAD，美国)。

动物模型建立 实验组大鼠给予高脂高糖饮食，构建饮食诱导性肥胖大鼠模型;对照组大鼠给予普通基础饲料正常喂养。饲养期间每周测量体长及体重。喂养至第9周 (8周+2 d)完成模型构建，实验组大鼠体重超过对照组体重均数的25%入选为肥胖组，对照组健存大鼠视为正常组进行后续实验。禁食12 h后，处死肥胖组和正常组入选大鼠，留取血样行生化指标检测并留取肾脏等组织器官以液氮保存备用。

生化指标检测及脂肪系数计算 处死实验组和对照组入选大鼠，留取血样后及时应用生化试剂盒检测血清葡萄糖、三酰甘油、总胆固醇;分离大鼠生殖器旁脂肪，称量脂肪湿重，用脂肪湿重除以大鼠体重计作脂肪系数。

正常与肥胖大鼠肾脏组织细胞质总蛋白的提取从液氮中取冷冻肾脏组织标本200 mg放入备用EP管中，置于冰上剪碎，加入1 ml 4℃预冷的PBS，然后在低温离心机4℃ 3000 r/min离心5 min，弃上清液，用PBS重复洗涤两次，弃上清液在沉淀中加入0.4 ml RIPA裂解液 (加入PMSF 10 μl+蛋白酶抑制剂5 μl)，然后置于冰上超声破碎 (5 s work+20 s rest，2 cycles)，最后在低温离心机上以4℃ 15000 r/min离心15 min，所得上清液即为细胞质蛋白提取液，放置－80℃备用。

细胞质总蛋白浓度的检测 参照BCA试剂盒说明按以下流程检测各组织细胞质总蛋白浓度:(1)根据待测样品数量配制工作液 (A液与B液的体积比为50∶1);(2)根据样品数量配制标准蛋白量(把5%BSA用PBS稀释到10倍);(3)把稀释好的标准蛋白按照 0、1、2、4、8、12、16、20 μl分别加入96孔板，然后用PBS把各孔溶液补到20 μl;(4)取10 μl样品加到96孔板对应位置，然后用PBS把各样品孔溶液补到20 μl;(5)向各孔中加入200 μl工作液，用加样器轻轻吹打，室温放置2 h，然后用酶标仪测量样品蛋白浓度为0.2～1μg。

免疫印迹 各组取等量蛋白 (5μg)上样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)，预留一泳道上彩虹预染的蛋白Marker，凝胶中分离胶8%，浓缩胶5%。电泳起始电压为80 V，待染料由浓缩胶进入分离胶后电压调至100 V，当染料抵达分离胶底部时(约120 min)终止电泳。电泳结束后，通过半干式转移电泳仪把蛋白转移到PVDF膜上，转膜条件为恒压9 V、30 min。成功转膜后，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开并分别标记，把膜置于含5%(质量分数)脱脂奶粉的封闭液 (5%脱脂奶粉、Tris-HCl pH 8.0、Tween20、NaCl)中4℃过夜封闭，用 TBST(Tris-HCl pH 8.0、Tween20、NaCl)洗膜5 s，然后把目的蛋白膜及内参蛋白膜分别置于1%BSA稀释的GIRK4一抗 (兔抗大鼠单抗，体积比1∶3000稀释)溶液和1%BSA稀释的内参 (小鼠抗GADPH单抗，体积比1∶2000)溶液中，室温孵育2 h。再次用TBST洗膜5×10 min，把由GIRK4一抗溶液孵育的目的蛋白膜、内参溶液孵育的内参蛋白膜分别放入1%BSA稀释的GIRK4二抗 (辣根酶标记山羊抗兔IgG，体积比1∶5000)、1%BSA稀释的GADPH抗体 (辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，体积比1∶5000)溶液中室温孵育2 h，然后用TBST洗膜5×10 min，ECL试剂盒暗室显影，X线胶片曝光、洗片可显示GIRK4及GADPH蛋白质条带。置于凝胶成像仪中照相并应用Quantity One软件对GIRK4及GADPH蛋白质条带灰度进行定量分析处理，用GIRK4蛋白目的条带与GADPH条带的灰度值比值表示GIRK4蛋白的相对表达强度 (GIRK4/GADPH)。

统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，符合正态分布的定量数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

两组大鼠一般情况比较 模型构建前，两组大鼠在体长及体重方面差异无统计学意义 (P均＞0.05);模型构建后，肥胖组大鼠体长及体重、脂肪垫湿重、脂肪系数均明显大于正常组 (P均＜0.001)，血糖、总胆固醇、三酰甘油水平也均明显高于正常组 (P均 ＜0.05)(表1)。

两组大鼠肾脏组织GIRK4蛋白的表达 肥胖组大鼠肾脏组织GIRK4蛋白相对表达量为1.75±0.42，明显低于正常组大鼠的3.37±0.68(P＜0.05)(图1)。

讨 论

图1 GIRK4蛋白在正常组 (1、2)与肥胖组 (3、4)大鼠肾脏组织的表达Fig 1 Protein expressions of GIRK4 in rats of normal group(1，2)and obese group(3，4)

GIRK4是GIRK家族成员之一，其在哺乳动物生命活动中具有重要的病理生理意义。Schoots等［5］在1999年用Northern blot技术就已描述了GIRK4在人体胰腺、胎盘、肺、心、脑等脏器的分布，但仅表述了GIRK4基因在人体部分脏器存在表达，而目前国内外对GIRK4在各脏器蛋白表达水平的定量研究鲜有报道，这一研究现状已不能满足指导科研工作者探索GIRK4基因与相关临床疾病间关系的需求。

在各种复杂的生理和病理情况下，正常原核生物体的机体能够根据自身需要从基因水平、转录水平、转录后加工和蛋白质降解等不同层次对蛋白质的合成进行调控［6］。蛋白质是基因表达在机体内的最终体现形式，其表达量体现了该基因对机体功能的影响程度。本研究在成功构建饮食诱导肥胖大鼠模型的基础上，采用Western blot技术对正常与肥胖大鼠肾脏GIRK4蛋白表达进行了定量分析，结果发现肥胖组大鼠肾脏组织GIRK4蛋白表达量明显低于正常组。

Perry等［3］研究表明，GIRK4基因在下丘脑的表达可能与肥胖、代谢综合征的发生密切相关。在周围组织器官中，肾脏作为机体重要的内分泌及代谢器官，参与肾素及促红细胞生成素的分泌，而且在调节水盐代谢平衡及胰岛素代谢中具有重要的作用。GIRK4基因在肥胖大鼠肾脏组织的低表达是否参与肾脏肾素分泌、胰岛素及水盐代谢等，进而影响机体血压调节及血糖、血脂代谢，目前国内外未见相关报道。

表1 正常组与肥胖组大鼠一般情况比较Table 1 Comparison of the general data between the normal rats and obese rats

高血糖、高血压、血脂紊乱分别与肥胖有关［7-8］，而且成人发生高血糖、高血压、血脂紊乱聚集与肥胖存在一定关联［9］。众所周知，肾脏在机体内作为代谢器官对胰岛素的代谢起着重要作用，而胰岛素代谢异常及胰岛素抵抗与众多临床疾病的发生发展密切相关，其中胰岛素抵抗不仅是2型糖尿病的重要发病环节之一，而且是代谢综合征、冠心病、高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素［10-11］。世界卫生组织关于代谢综合征的诊断标准中明确将胰岛素抵抗列为诊断标准之一，并强调了胰岛素抵抗在代谢综合征中的重要性。大量流行病学调查结果表明，高胰岛素血症和高血压呈明显的正相关［12-13］，高胰岛素血症可能介入了肥胖所致高血压，是肥胖与高血压相关联的桥梁。杨剑等［14］研究显示，胰岛素可调节肾脏近曲小管上皮细胞多巴胺D5的表达与功能，该调节作用异常可能在高血压的发生发展中发挥一定作用。在高血压的形成机制中除了胰岛素抵抗的可能因素外，GIRK4基因在肥胖大鼠肾脏低表达对肾素水平的影响亦可能是导致肥胖机体高血压发病率较高的原因之一。Ziccardi等［15］研究表明，体重减轻后循环及脂肪组织中肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性降低，是降压的主要机制，同时还可改善内皮功能和压力反射，降低交感神经活性。综上，肥胖机体内的一系列病理生理变化可能与肥胖机体内肾脏组织GIRK4基因异常表达之间具有一定关联性，但尚需要进一步研究证实。

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