基于金枪鱼K值变化的MTT快速传感器的研究及响应面设计
2013-08-07奚春蕊包海蓉缪函霖
奚春蕊,包海蓉,刘 琴,缪函霖
(上海海洋大学食品学院,上海201306)
金枪鱼是大洋暖水性洄游鱼类,肌肉强劲,肉质柔软鲜美,蛋白质含量高,氨基酸配合优越,富含DHA、EPA等具有生物活性的多不饱和脂肪酸,是国际营养协会推荐的绿色无污染健康美食[1]。为了维持金枪鱼的优良品质,鱼从海上捕获直至人们的餐桌上,需放置在-50℃的低温条件下冷冻保藏[2]。在加工过程中,通常以生鱼片的加工方式来维持金枪鱼的品质、营养和风味。为了维持金枪鱼的优良品质,鱼从海上捕获直至人们的餐桌上,需放置在-50℃的低温条件下冷冻保藏[2]。然而根据日式料理店的现场调研发现,料理店对生鱼片的贮存、解冻,再加工的具体骤操作模糊,没有良好的温度控制,对原料不同阶段的新鲜度和判断生食依据仅仅局限在传统的感官检测,不能系统准确地了解生鱼片的品质情况。传统的品质指标包括pH、持水力、感官评价等都不能较准确的反应生鱼片在冷藏过程中的品质下降程度。通过这一技术的开发可以在各个环节的节点进行快速检测,方便企业品控人员以及质检机构及时了解产品品质。近年来已对一般鱼肉鲜度快速评价有所研究,主要在微生物、挥发性物质、ATP降解产物等,快速检测方法包括图像分析、色差测量、近红外光谱测量、挥发性物质测量、物性(质地)分析[3-8]。国内外专家就生物传感器在鱼肉鲜度检测方面的研究也日益深入。干宁等[9]通过安培法检测,利用三种以二茂铁甲酸(FCA)为媒介体的导电聚吡咯酶电极,分别固定黄嘌呤氧化酶(XO)、核苷磷酸化酶(NP)和核苷酸酶(NT),定量检测HX、INO、IMP,用来检测淡水鱼的鲜度。Hirokazu Okuma[10]以及Youko Nanjyo等[11]国外学者又在氧电极后连接转换器和计算机,实现了自动化数据处理。普通的快速检测方法,对于金枪鱼等品质变化极快的生鱼片无法准确快速的检测,同时由于复杂设备受限,一般快速检测方法无法运用于普通消费者。其次生鱼片原料成本价格昂贵,一般传统检测取样量大,而造成不同的经济效益损失。因此研究一种快速的无损伤的品质检测方法尤为重要。本研究基于金枪鱼在低温贮藏过程中K值变化,以黄嘌呤氧化酶(XOD)、MTT噻唑蓝及Hx黄嘌呤的反应,通过反应产物的浓度及颜色变化与K值的变化建立相关性,采用响应面的实验方法,对MTT传感器的反应条件进行优化,建立能够与K值变化基本相同的反应模型。通过传感器颜色即可快速准确评价金枪鱼的品质。为金枪鱼下游消费的品质控制提供理论依据和快速检测技术。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
黄鳍金枪鱼 中水集团远洋股份有限公司,于斐济岛捕获后直接冻藏-60℃冷库中,将-60℃冻存的鱼肉,体积约120mm×63mm×18mm(长×宽×厚),用零度3%的冰盐水浸渍,形成冰衣后置于4℃冷藏室,直至完全解冻,每隔4h取出鱼样测定K值;甲醇 色谱纯;高氯酸、氢氧化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无水乙醇、盐酸、Tris-Base 分析纯,国药上海公司提供;ATP关联物:5’-腺苷三磷酸二钠盐,高纯(98%)、5’-腺苷二磷酸二钠盐,高纯(98%)、5’-腺苷一磷酸二钠盐,高纯(95%)、5’-肌苷一磷酸二钠盐,超纯(99%)、肌苷,超纯(99%)、黄嘌呤,高纯(98%) 上海楷洋生物技术有限公司;黄嘌呤氧化酶,BR 90U/mg 500U 上海源叶生物技术有限公司;噻唑蓝(MTT)Sigma公司。
冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;XHF-1组织粉碎机 上海金达生化仪器;LC-10AT高效液相色谱、SPD-10A紫外检测器 日本岛津;紫外分光光度计(T6世纪) 北京普析通用;低温恒温箱 上海一恒科学仪器有限公司;pH计SG2、电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.2 K值测定方法
ATP及其降解产物的提取和测定主要参考文献[12],稍作调整,精确称量约5g鱼肉,加10% PCA(高氯酸)溶液15mL均质,冷冻离心机4℃3000r/min离心3min,上清液用滤纸过滤,滤液再加入5% PCA(高氯酸)溶液10mL均质,冷冻离心机4℃3000r/min离心3min,上清液再次过滤,重复上述操作2次,过滤后用10mol/L KOH和1mol/L KOH调整滤液pH至6.35~6.4之间,用去离子水定容至50mL,上述溶液用孔径为0.45μm的滤膜过滤,于-50℃下用小离心管冻藏,解冻后用于HPLC测定,整个过程冰浴操作,并保持环境温度在4℃左右。
HPLC条件[13]:使用紫外检测器,流速1.0mL/min,进样量10μL,检出波长260nm。色谱柱:ZORBAX SBC18(250mm×46mm×5μm),流动相:0.07mol/L KH2PO4:0.03mol/L K2HPO4(V∶V=1∶1,pH6.45),采用外标法定量。
1.3 噻唑蓝MTT传感器
1.3.1 缓冲溶液的选择 将2.5mL 含2mg 噻唑蓝(MTT)的90%乙醇-1mol/L的Tris-HCl缓冲液,和2mL含2mg黄嘌呤(Hx)的相同缓冲液混合于比色管中,混匀,使药品充分溶解后,加入0.4U的黄嘌呤氧化酶(XOD)。
HCL调节90%乙醇-1mol/L的Tris-HCl缓冲液缓冲溶液pH分别为7.4、7.6、7.8、8.0、8.2,24h后在565nm处测定吸光度。确定传感器缓冲溶液最适pH。
1.3.2 单因素实验
1.3.2.1 噻唑蓝(MTT)添加量 将2mL含有2mg黄嘌呤(Hx)、pH为7.8的缓冲溶液与2.5mL分别含1、1.5、2、2.5、3mg的MTT相同缓冲溶液混合均匀,加入0.4当量的黄嘌呤氧化酶(XOD),置于4℃冷藏室中,经历鱼样相同的时间,每隔4h,取出在565nm处测得吸光度。测得传感器吸光度的变化与K值的变化进行配对检验及相关性分析。
1.3.2.2 Hx含量 将2mL分别含有1、1.5、2、2.5、3mg黄嘌呤(Hx)、pH为7.8的缓冲溶液与2.5mL分别含2mg噻唑蓝(MTT)相同缓冲溶液混合均匀,加入0.4当量的黄嘌呤氧化酶(XOD),测定方法同MTT单因素实验。
1.3.2.2 XOD添加量 将2.5mL含2mg噻唑蓝(MTT)的缓冲液,和2mL含2mg黄嘌呤(Hx)的相同缓冲液混匀,分别加入0.2、0.3、0.4、0.5、0.6U的黄嘌呤氧化酶(XOD)。测定方法同MTT单因素实验。
1.3.3 传感器实验方法与设计
1.3.3.1 MTT传感器设计 MTT[3-(4,5-dimethylthiazo-l2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide]噻唑蓝是一种四唑盐,活细胞线粒体呼吸链上的脱氢酶(如:琥珀酸脱氢酶和心肌黄酶等)能将黄色的噻唑蓝还(MTT)原成蓝紫色的甲臜(FMZ),且FMZ生成量与活细胞量成正比[14]。其反应式如下:
图1 MTT在酶作用下的反应过程Fig.1 MTT reaction equation by enzymes
黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)简称XOD(EC.1232),是生物体内核酸代谢过程中的重要酶类[15]。黄嘌呤氧化酶广泛存在于动物的组织中,是一种氧化还原酶类,可以把黄嘌呤、次黄嘌呤氧化成尿酸;把脂肪族、芳香族醛氧化成羧酸;还能氧化嘧啶类、嘌呤类、蝶啶类物质及NADPH。
黄嘌呤氧化酶可把次黄嘌呤、黄嘌呤氧化成尿酸,当有嘌呤存在时,催化反应表现为底物的羟基化,而醛则被氧化成羧酸,见图2[16]。
MTT传感器是基于XOD酶的作用下有Hx和MTT进行反应生成FMZ含量随时间温度变化而发生改变,通过吸光度的测试来反应实验过程。
图2 酶催化反应方程Fig.2 Enzyme catalytic reaction equation
1.3.3.2 传感器实验方法 根据单因素实验,采用Minitab 16软件建立Box-Behnken模型,实验因素水平编码见表1。实验以XOD添加量、Hx含量和MTT含量为因素,以传感器反应化学产物FMZ生成速率,即反应体系颜色变化,通过测得反应体系的吸光度与相同条件下K值进行的计算相关性,以相关性为响应值,对数据进行统计分析。蔡智澄等[17]在相关性分析原理中提出相关系数,它是由英国统计学家卡尔·皮尔逊提出的,其数学表达式为:
式中,X和Y为两个待研究变量。
表1 Box-Behnken实验设计因素水平编码Table 1 Factors,levels and coding table of Box-Behnken design test
1.4 实验数据处理
实验进行三次平行实验,使用Origin 8.0、Minitab 16、Excel 2007软件分析计算。
2 结果与讨论
2.1 4℃冷藏条件下金枪鱼K值变化
ATP分解过程中,以HxR和Hx浓度的总和与ATP关联物浓度的总和的比值,即为K值。是鱼肉鲜度的重要指标,就金枪鱼而言,当K值小于20%,即为良好鲜度的金枪鱼,当K值大于50%时,达到保鲜的最大上限。K值可有效反映鱼体在僵硬期至自溶期的不同鲜度。
金枪鱼在4℃冷藏过程中,随着时间的延长鱼肉中肌苷和黄嘌呤的含量不断增加,K值也不断上升,经过解冻后的初始K值为6.512,经过32h后变化为20.111,上升至初始值的三倍。当K值在20%以下时,金枪鱼鱼肉的品质能够达到生产生鱼片的优良等级,因此以K值20%为生食终点为标准[18]。4℃贮藏终点约为32h左右。同时根据一级动力学方程A=A0×e-kt[19-20],计算出K值变化的速率常数为0.1463。
图3 金枪鱼K值4℃冷藏期间的变化Fig.3 Changes in K value in Tuna during storage at 4℃
2.2 MTT传感器研究与响应面优化
在MTT化学传感器中,由于黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下,在生成尿酸的同时产生呼吸链上的脱氢酶,还原黄色噻唑蓝,生成蓝紫色的甲臜(FMZ),通过测定吸光度来确定生成甲臜(FMZ)的含量,通过传感器颜色表征为从黄色变为蓝紫色,FMZ含量越高,传感器颜色越深[21-22]。通过吸光度的颜色变化与相同条件下K值变化进行相关分析,即可确定传感器的各项条件,间接的评价金枪鱼的品质。
2.2.1 pH对MTT传感器的影响 黄嘌呤氧化酶XOD的等电点是5.3~5.4,最适pH在8.3左右,当pH在酸性范围内时,酶活性随pH的下降而降低,当pH高于10.15时,则酶活性随pH 的升高而急剧下降[23]。而MTT水溶液在pH7.0以下稳定,3~5周内不变性,在pH7.0以上溶液中不太稳定。因此考察了pH对传感器缓冲液的影响[21]。
传感器4℃环境下,不同pH缓冲液,放置24h测得吸光度值见图4。
图4 不同pH缓冲液MTT传感器吸光度值Fig.4 Absorbance value of MTT sensor at different pH
根据图4可以看到,在pH在8.2的缓冲溶液中,MTT传感器的吸光度最大,且通过统计分析各pH的吸光度有极显著性差异(p<0.01)。这可能是因为XOD对pH的敏感程度大于MTT,MTT在24h内,缓冲体系较稳定。pH缓冲体系的pH较接近XOD的最适pH。因此固定MTT传感器缓冲液体系的pH为8.2。
2.2.2 单因素实验与K值的相关性结果
2.2.2.1 Hx含量单因素结果 表2为Hx含量对传感器吸光度与K值相关性的影响,可以看出不同Hx的添加量对传感器吸光度的变化与同样条件下K值变化具有相关性差异。添加量为2.5mg的水平数时,相关系数最大,同时不同的Hx添加量反应过程基本符合一级反应动力学模型,其中2.5mg的水平数对K值拟合程度最高。因此可以确定Hx含量的水平数为2、2.5、3mg。
表2 Hx含量对传感器吸光度与K值相关性的影响Table 2 Effect of Hx content on the correlation between sensor absorbance and K value
2.2.2.2 MTT含量单因素结果 表3为MTT含量对传感器吸光度与K值相关性的影响,与Hx含量对传感器吸光度对K值变化相同,同样具有显著相关性,且不同的添加量相关性差异显著。其中2mg的水平数,相关系数最大,从拟合系数看,最符合一级反应动力学模型,同时从表3中可以看出,高浓度的MTT含量的拟合度要明显高于低浓度的MTT含量。因此确定MTT含量的水平数为2、2.5、3mg。
表3 MTT含量对传感器吸光度与K值相关性的影响Table 3 Effect of MTT content on the correlation between sensor absorbance and K value
2.2.2.3 XOD添加量单因素结果 表4为XOD添加量对反应体系吸光度与K值相关性的影响。不同当量的XOD对反应体系吸光度与K值变化的相关性有显著影响。添加量为0.2U的相关系数最大,但与一级反应动力学模型的拟合程度不高,与K值变化规律不符。因此确定XOD添加量的水平数位0.3、0.4、0.5U。
表4 XOD添加量对传感器吸光度与K值相关性的影响Table 4 Effect of XOD content on the correlation between sensor absorbance and K value
2.2.3 响应面法优化MTT传感器结果 根据Box-Behnken实验设计原理,用XOD含量X1、Hx含量X2、XOD添加量X3,3个因素水平进行实验,表5为响应面实验设计与实验结果[24]。
表5 响应面法设计与实验结果Table 5 Design and experimental results of RSM
采用Box-Behnken对金枪鱼K值变化与MTT传感器吸光度变化相关性进行MTT传感器各因素水平进行优化,考察MTT含量、Hx含量、XOD添加量对相关性的影响,进行了12个分析因实验和3个中心实验,表5给出各实验的数据。对响应值与各因素进行回归拟合后,得到回归方程:
对模型式(2)进行方差分析和回归系数显著性检验,结果见表6。方差分析表明,该二次响应面模型F值为7.23>F0.05(9,4)=6.00,p<0.05,表明所选用的二次多项式模型具有显著性(p<0.05)。失拟项F值<F0.05(9,3)=8.81,p=0.105>0.05,表明失拟不显著。回归模型的确定系数R2=0.9287,说明该模型能解释92.87%响应面的变化,该模型的拟合程度良好,实验误差较小。因此可以用该模型对MTT传感器吸光度变化与K值变化的相关性进行分析和预测。
表6 回归模型方差分析Table 6 Variance analysis for the regression model
系数显著性检验可知,如果模型检验项p值小于0.05,则该项是显著的,否则该项不显著,因此由表6可知:一次项X1(p=0.015)、X3(p=0.026)显著,即XOD添加量和MTT含量对相关性结果有显著影响,二次项X22(p=0.002)显著,交互项均不显著。根据模型各因素的回归系数式(1)绝对值大小,可以得到各因素的对传感器吸光度与K值变化的相关性影响的主次顺序为:X1>X3>X2,即XOD黄嘌呤氧化酶的添加量>MTT噻唑蓝的含量>Hx黄嘌呤的含量。
2.2.4 MTT传感器吸光度变化与K值变化相关性最优条件的确定及模型验证 根据回归方程,得到各因素交互作用的响应面图和等高线图如图5~图7。从响应曲面的最高点可以看出,在所选范围内存在极值,响应面的最高点同时也是等值线最小椭圆的中心点,由图5~图7可知,该回归方程存在稳定点,即有极大值点,与方差分析的结果一致。
图5 XOD添加量、Hx含量对K值和传感器吸光度变化相关系数的曲面图Fig.5 Surface of mutual-influence of XOD content and Hx content on the correlation between sensor absorbance and K value
图6 XOD添加量、MTT含量对K值和传感器吸光度变化相关系数的曲面图Fig.6 Surface of mutual-influence of XOD content and MTT content on the correlation between sensor absorbance and K value
图7 Hx含量、MTT含量对K值和传感器吸光度变化相关系数的曲面图Fig.7 Surface of mutual-influence of Hx content and MTT content on the correlation between sensor absorbance and K value
用Minitab软件通过对回归方程模型进行优化求解,得到MTT传感器最优条件参数为X1=0.7980,XOD的添加量为0.4798U,X2=-0.1111,Hx 的含量为2.4445mg,X3=0.5152,MTT含量为2.7576mg,此时得到最大相关性值为0.9924。考虑到实际可操作性,将三个值进行修正:XOD添加量为0.5U,Hx含量2.4mg,MTT的含量为2.77mg,进行三次验证实验,相关系数平均值为0.9882,相对误差0.42%,与理论计算值基本吻合。因此,利用响应面法得到的MTT传感器的最优条件与K值变化相关性最高。
3 结论
基于金枪鱼在冷藏过程中K值的变化,以MTT噻唑蓝、Hx黄嘌呤、XOD黄嘌呤氧化酶的反应所研发的K值即鲜度的的化学传感器,在冷藏温度为4℃,K值终点为20%时,研究了时间、K值变化与传感器吸光值的相关性。
3.1 金枪鱼在4℃冷藏过程中,随着时间的延长鱼肉中肌苷和黄嘌呤的含量不断增加,K值也不断上升,32h后K值为21.111,达到贮藏终点。
3.2 根据响应面Box-Behnken实验设计理论进行MTT传感器吸光度和K值变化相关性的实验结果表明二次响应面模型拟合度较高,适合于对MTT传感器条件的优化,使其余K值变化的相关性提高。得到的优化结果为:XOD添加量为0.5U,Hx含量2.4mg,MTT的含量为2.77mg。
3.3 通过实验分析MTT传感器在冷藏条件下吸光度的变化,与相同条件下金枪鱼K值的变化具有很大的相关性,相关系数均在0.9以上,因此该传感器可以运用于对于金枪鱼品质鲜度的快速检测。
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