赵 玲，王程程，李敏通，王蓉晖，李延斌，胡耀华，*

(1.西北农林科技大学机械与电子工程学院，陕西杨凌712100;2.美国阿肯色大学生物和农业工程系，阿肯色州费耶特维尔72701)

志贺氏菌属是革兰氏阴性、兼性厌氧、无芽孢、不运动、通常不发酵乳糖的棒状杆菌。志贺氏菌属是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位［1］。目前在国内外，直接从食品中制备的样品往往因为含有的目标微生物太少难以检测，所以大多都采用先增菌后检测的方式，这时不仅会耗费大量的时间，而且检测可信性差［2］。利用人工合成的磁性颗粒对目标细菌进行分离、浓缩进而检测的方法在以往已经有了快速的发展［3］。细胞的磁性分离与其他的分离方法相比可以使细胞直接从原始的食品样品里分离并且简单、快速，与电磁场相比，静磁场也不会干扰水溶液中离子和带电溶质的移动。目前已有利用免疫纳米磁珠实现对食源性病原菌如大肠杆菌［4］、沙门氏菌［5］、李斯特菌［6］、阪崎杆菌［7］等肠道致病菌的特异、快速的富集，并结合量子点荧光标记、吸光度检测、ELISA 等方法或是各种PCR 方法实现对单个或多种目标菌的定量检测［8-14］。目前还没有采用该种方法对志贺氏菌进行分离、富集的报道，本研究制备免疫纳米磁珠(immunomagnetic nanobeads，Immuno-MNBs)，将针对目标抗原的特异性抗体直接包被于磁珠的表面，从而能够识别目标微生物，利用其超顺磁性和特异性，对食品中的福氏志贺氏菌在磁场中进行特异性捕获，实现对食品中福氏志贺氏菌的快速、高效、特异性分离和富集。为更简便、快捷的定量检测志贺氏菌做好前期准备。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草原兴发冷冻羊肉卷 购于当地超市;福氏志贺氏菌(ATCC12022) 购自美国菌种保藏所;生物素化的志贺氏菌多克隆抗体(4 ～5mg/mL) 购于Pierce Biotechnology 公司;链酶亲和素纳米磁珠(以CdSe/CdTe 为核的核壳结构，粒径(180 ±20)nm)购于江阴美英特生物仪器科技有限公司;磷酸盐缓冲液(PBS，0.1mol/L，pH7.4) 购于Sigma 公司;LB肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂、Baird-Parker 培养基基础等 均购于北京陆桥公司;实验中所用耗材均为无菌。

MS0206 磁分离器(0.4T) 江阴美英特生物仪器科技有限公司;YT-CJ-1N 型超净工作台 北京亚泰科隆实验科技开发中心;PB-10pH 计 德国Sartorius 公司;智能恒温恒湿培养箱 宁波海曙赛福实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫纳米磁珠的制备 取生物素化的志贺氏菌多克隆抗体和链酶亲和素化的磁珠，分别用适量PBS 稀释混匀后按照GB4789.5-2012 的方法，在麦康凯琼脂培养基上铺盘，放置在37℃恒温培养箱里培养20～24h，观察有无杂菌。若有杂菌，用1% NaN3处理24h，用PBS 充分洗涤后再铺盘观察，若无杂菌则可直接用于以下实验。

取1mL 链酶亲和素纳米磁珠((180 ±20)nm，2mg/mL)3 份，在磁分离器上分别用500μL 的PBS进行洗涤，各2 次。分别用450、430、410μL 的PBS重新悬挂，依次移取50、70、90μL 的生物素化的志贺氏菌抗体(4～5mg/mL)加入到已洗好的磁珠溶液中，使总体积均达到500μL，涡旋混合均匀后，在试管混合器上混合，室温反应30min［15-16］。反应完全后利用PBS 洗涤，在磁分离器(0.4T)上分离1.5min 后去掉上清液，重复清洗2 次，加1%牛血清蛋白(纯度＞98%，WOLSEN 公司)的PBS 混合60min，对磁珠上链酶亲和素的多余位点进行封闭。封闭完成后用PBS 彻底清洗2 次，再用1mL 的PBS 重悬，得到的免疫纳米磁珠复合物分别标记为:Immuno-MNBs50，Immuno-MNBs70，Immuno-MNBs90。

1.2.2 细菌培养与计数 蘸取少量福氏志贺氏菌的冻干粉加入到营养肉汤中进行活化(37℃，20h)，再在麦康凯琼脂培养基上分离出纯的单菌落，在营养琼脂上再次扩大培养后的菌种保存于甘油和营养肉汤按1∶1 比例配制的保存液里。

取上面保存液里的纯的福氏志贺氏菌种1～9mL的LB 营养肉汤中，培养10h 时移取1mL 于事先灭菌好的PBS 里进行一系列稀释，依次编号为1、2、3、4、5、6、7、8 以及一个空白。由平板计数的方法得知各梯度目标细菌数。

1.2.3 对纯菌液里目标细菌的捕获 分别取出Immuno - MNBs50，Immuno - MNBs70，Immuno -MNBs90 三种免疫磁珠各20、40、60μL 与104CFU/mL接种量的目标菌100μL，用PBS 溶液定容到1mL 后在试管摇床上以15r/min 的转速在室温下反应45min［15-16］。反应完成后用PBS 洗涤至少2 次，废液收集并保存，用1mL 的PBS 重悬反应复合物，以得到103CFU/mL 细菌数量时各种免疫磁珠的捕获效率。分别对纯菌液、免疫磁珠捕获的菌液、以及废液进行铺盘(作对照)，各做三个平行实验。

再取Immuno-MNBs70 各40μL 和60μL 分别与接种量为103、104、105CFU/mL 的纯菌液100μL 在室温下混合反应45min。反应完成后洗涤，去掉多余的清液(废液需收集)，用1mL 的PBS 重悬反应复合物，需要稀释才能读数的组系按细菌数量适量稀释。分别对各梯度目标细菌的纯菌液、免疫磁珠捕获的菌液、废液进行铺盘，各做三个平行实验。将分别得到40μL 和60μL 的Immuno-MNBs70 对102、103、104CFU/mL 细菌数量目标细菌的捕获效率。

理论上，捕获效率(capture efficiency，CE)CE(%)=Nc/N0×100，其中，Nc是捕获得到的细菌数，单位为CFU/mL;N0是原始的细菌数量，单位为CFU/mL。

1.2.4对低浓度目标菌的捕获 取100、101、102CFU/mL 接种量的纯菌液1mL 在室温下分别与Immuno-MNBs70 的免疫磁珠60μL 混合反应45min。反应完成后洗涤，废液收集，用1mL 的PBS 重悬反应复合物。分别对原始纯菌液、免疫磁珠捕获的菌液、废液进行铺盘，各三个平行实验。

1.2.5 对食品中目标菌的捕获 称取25g 羊肉样品于225mL 已灭菌的0.1%的PBS 缓冲液中，混合1min后，移取4 份样液，其中一份为10mL 不接种做为空白实验。其余三份为9mL，接种福氏志贺氏菌(ATCC12022)，使样品里最终细菌数量达到101～103CFU/mL。样品前处理好后，添加免疫磁珠Immuno-MNBs70 各60μL 分别对空白实验、101、102、103CFU/mL 浓度的目标菌进行捕获，捕获后洗涤，废液保留，对纯菌液、捕获得到的菌液、废液均铺盘计数。

1.2.6 数据分析 本实验所有的微生物检测都重复三次实验，以确保实验结果的重现性。所有目标细菌捕获效率的平均值和标准偏差值都通过Microsoft Excel(Microsoft Corporation)计算得到。

2 结果与分析

2.1 多克隆抗体包被链酶亲和素纳米磁珠加入量的优化选取

分别用Immuno - MNBs50，Immuno - MNBs70，Immuno-MNBs90 三种免疫磁珠各20、40、60μL 三种不同加入量捕获103CFU/mL 细菌数量的福氏志贺氏菌。由图1 可以看到，免疫纳米磁珠Immuno-MNBs70 对目标细菌的捕获效率最高，它在40μL 和60μL 加入量时分别可达到58.6%和61.2%，所以可以选取70μL 的生物素化抗体为制备免疫纳米磁珠时的较优加入量。Immuno-MNBs50 在60μL 的加入量时也达到了59.4%，说明60μL 加入量的捕获效率最好。而抗体加入量为90μL 的免疫纳米磁珠Immuno-MNBs90 对目标菌的捕获效率在8.9% ～25%之间，如图1 所示。可能当加入的抗体过多时，吸附到细菌上的免疫磁珠增多，在强磁场下分离的时候会造成部分细菌的损伤，由此可知，纳米磁珠对目标细菌的捕获效率并不随着抗体加入量的增多而增高，而是可以得到一个优化值。

图1 三种抗体浓度的Immune-MNBs对103CFU/mL 目标细菌捕获效率的比较Fig.1 The capture efficiency of the three different antibody concentrations of Immune-MNBs for 103CFU/mL target bacteria

2.2 免疫磁珠捕获目标细菌时其加入量的选取

用免疫磁珠Immuno-MNBs70 的40μL 和60μL的加入量分别捕获102、103、104CFU/mL 细菌数量的福氏志贺氏菌。发现对于细胞数量为102、103、104CFU/mL 的细菌，40μL 和60μL 的加入量对其捕获效率都非常的接近，通过t 检验，|t| =7.0 ＜t(2)0.01=9.925，则p ＞0.01，说明对于102、103、104CFU/mL 的细菌数量，40μL 和60μL 的加入量对捕获效率的差异显著性不大，捕获效率在60μL 时比40μL 时略高，如图2 所示，选取免疫磁珠较优加入量为60μL。

图2 Immuno-MNBs70 不同加入量对102、103、104CFU/mL 目标菌的捕获效率比较Fig.2 The capture efficiency comparison of the different addition amount of the Immuno-MNBs70 for 102，103，104CFU/mL target bacteria

2.3 对低浓度目标细菌的捕获

用免疫纳米磁珠Immuno-MNBs70 的60μL 加入量捕获101、102CFU/mL 细菌数量的目标菌，得到的捕获效率分别是:83.8% ±2.2%、65% ±3.0%。可以看出较高浓度的目标细菌，免疫纳米磁珠对低浓度目标细菌捕获效率有所增大。对于100CFU/mL 数量的目标菌，即个位数量的菌液，菌落计数如表1。可见，该种捕获方法的捕获限可以达到100CFU/mL。

表1 该免疫磁珠对100CFU/mL 目标菌的捕获结果Table 1 The capture efficiency of the Immuno-MNBs to 100CFU/mL number of target bacteria

2.4 对食品样品中福氏志贺氏菌的检测

在未接种福氏志贺氏菌的空白实验中，样液、捕获液和废液里均有极少量的非福氏志贺氏菌的杂菌出现。除去极少量非福氏志贺氏菌杂菌外，对于102和103CFU/mL 接种量的食品样品，得到的捕获效率分别为73.3% ±4.6%和67.1% ±2.5%，对101CFU/mL 样品液，其样液与捕获液的菌落数相近，而且废液里也无目标菌出现。说明对于羊肉样品，其捕获限可达到101CFU/mL，这对食品中低浓度目标菌的快速检测有良好的效果。

与已有的以SPA 包被的磁珠制备的多抗免疫磁珠对福氏志贺氏菌纯菌液(102CFU/mL)的富集作用(捕获效率约为46.9%)相比［17］，该方法可以达到较高的捕获效率(65%)，并且与GB4789.5-2012 的分离方法相比较，该方法不需要对食品样品进行16～20h 的增菌处理，可以节省时间。

3 结论

3.1 志贺氏菌多克隆抗体(4～5mg/mL)包被1mL 链酶亲和素纳米磁珠((180 ±20)nm，2mg/mL)的最佳加入量应该选取为70μL，在捕获高浓度目标细菌时，该制备好的免疫纳米磁珠的最佳加入量应为60μL，此时捕获效率最高，对于103CFU/mL 细菌量目标细菌的捕获效率可达到61.2%。

3.2 对于低浓度纯菌液目标菌的捕获，其捕获效率比较高浓度菌液有所提高，捕获限可以达到100CFU/mL，对于羊肉卷样品，免疫磁珠对目标菌的捕获限可以达到101CFU/mL，并且捕获时间小于1h。

3.3 利用免疫纳米磁珠能够快速、有效地对食品样品中目标细菌进行富集、分离，对以后能够快速、准确的定量检测食品中的目标细菌提供了理论依据，并且该实验可以得到3～4CFU/mL 目标细菌数量的捕获限，这对食品安全检测意义重大。

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