曾 晶 王子龙 吴小波 颜伟玉 曾志将

（江西农业大学蜜蜂研究所，南昌 330045）

蜂王和工蜂都是由受精卵发育而成，它们的遗传物质完全相同，但由于幼虫发育过程中得到的食物和发育空间的不同，发育形成形态、寿命以及其它许多生物学特性迥然不同的蜂王和工蜂，这就是蜜蜂级型分化现象。

蜜蜂级型分化机理，一直是广大生物学家所关注热门研究领域。早期的研究者认为：食物数量和成分差异是引起蜜蜂级型分化的主要原因[1]。近几来的研究表明：DNA甲基化、组蛋白修饰、“royalactin”蛋白质都与蜜蜂级型分化相关[2-4]。

Ku charski等受果蝇实验启示，通过检测dynactin p62甲基化水平的差异来研究西方蜜蜂（Apis mellifera）级型分化，结果发现营养因素可通过影响DNA 甲基化水平调控西方蜜蜂级型分化[2]。Shi等首次发现空间因素也可以通过影响dynactin p62的甲基化来调控西方蜜蜂雌的级型分化[5-6]，并且发现：发现饲喂异种蜂王浆可以更显著降低雌性蜜蜂幼虫dynactin p62基因甲基化水平[7]。但目前关于蜜蜂DNA甲基化的研究主要集中在西方蜜蜂上，对中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）的甲基化模式研究很少。正是鉴于此，我们在对中蜂dynactin p62基因克隆及差异表达研究此基础上[8]，开展了发育营养和空间因素对中蜂幼虫dynactin p62基因表达影响的研究工作，现总结报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试蜜蜂

取自江西农业大学蜜蜂研究所饲养的中华蜜蜂。

1.1.2 试剂及仪器

试剂：总RNA提取试剂盒Trizol，RNA酶抑制剂购自全式金公司；DNA marker DL2000，M-MLV反转录酶及SYBR GreenⅡ荧光定量试剂购自TaKaRa公司。

仪器：普通离心机（飞鸽 KA-1000 型，上海安亭科学仪器厂公司产品），台式冷冻离心机（Eppendorf 5810R），移液器（Eppendorf公司产品），普通 PCR仪（Eppendorf Mastercycler personal），MyiQ2 Real-Time PCR System（Bio-Rad公司产品）。

1.2 实验方法

1.2.1 隔王产卵

为了得到基本一致1日龄幼虫，用隔王框进行隔王产卵。

1.2.2 实验分组

实验分为A、B、C三个组，A组是在王台中，移入1日龄幼虫，一直饲喂新鲜蜂王浆直至6日龄幼虫；B组是在王台中，移入1日龄幼虫，前3天饲喂新鲜蜂王浆，后3天饲喂大幼虫食物直至6日龄幼虫；C组是在工蜂巢房中，移入1日龄幼虫后，一直饲喂新鲜蜂王浆直至6日龄幼虫。这样A组和B组是发育空间一样，营养因素不同；A组和C组是营养因素一样，发育空间不同。

1.2.3 人工饲喂幼虫

吸取0.2ml新鲜蜂王浆（或大幼虫食物）于王台或工蜂巢房中，放入培养箱中（温度35℃，湿度90%）30min，用移虫针移取1日龄至王台或工蜂巢房中，幼虫浮在食物上，每隔12h换一次食物。

1.2.4 样品采集

每个实验组取8只发育正常的6日龄幼虫，每只幼虫作为1个样品，用于dynactin p62基因表达量的检测。取样后蜜蜂幼虫样品迅速放入液氮速冻，-80℃保存，用于提取总RNA。

1.2.5 RNA的提取和cDNA第一链的合成

每个样品用液氮研磨后，用 Trizol 试剂盒进行RNA 的提取。所有操作均按照试剂盒说明书进行，RNA最后溶于30 μL RNA-free的DEPC水中，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测后，放入（80℃保存。用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，反应体系为50 μL：8 μL总RNA，10 μL Buffer，8 μL dNTP，1.5 μL M-MLV反转录酶，3 μL Oligo dT，1 μL RNA酶抑制剂，18.5 μL DEPC水。反转录反应条件如下：体系混匀后，42℃反应60 min，75℃ 5 min。反转录产物保存于（80℃。

1.2.6 荧光定量PCR

定量引物设计：在中华蜜蜂dynactin p62基因阅读框区设计多对特异引物用于定量 PCR 反应，根据Livak和Schmittgen的方法，本研究对设计的特异性荧光定量引物进行了筛选，获得符合要求的特异性引物，用于后续的实时荧光定量 PCR 反应。同时本研究以β-Actin 基因作为内参基因（引物为βact-Q-F和βact-Q-R）。荧光定量所用引物序列（表1）。

表1 中华蜜蜂dynactin p62基因引物

荧光定量 PCR 反应：qRT-PCR反应体系为10 μL：2μL反转录产物，目的基因上游和下游引物各0.3 μL，2.4 μL H2O，5 μL SYBR GreenⅡ；PCR扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60.9℃和55.8℃（分别对应基因引物和内参引物）退火45 s，72℃延伸40 s，40个循环；72℃延伸10 min；最后以每5 s上升0.5℃的速度从61℃到95℃记录熔解曲线，每个反转录cDNA样品。反应结束后收集目的基因与内参基因的CT值。

1.3 数据统计与分析

收集目的基因（dynactin p62）与内参基因（β-Actin）的CT值，用qpcR package，R（Hornik 2011）软件计算扩增效率，计算基因相对表达量（r）的数据分析方法参考Huang等（2012）[9]。

各试验组基因表达量的差异，采用StatView软件“ANOVA and t-test”中的“ANOVA or ANCOVA”进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 营养因素对中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达影响

在发育空间因素不变的情况下，虽然A组和B组3日龄后的幼虫食物营养因素不同，但两组6日龄幼虫dynactin p62基因表达量差异不显著（P>0.05）（图1）。

图1 营养因素对中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达影响

2.2 空间因素对中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达影响

在发育营养因素不变的情况下，A组和C组幼虫发育空间因素不同，两组6日龄幼虫dynactin p62基因表达量差异显著（P<0.05）（图2）。

图2 空间因素对中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达影响

3 讨论

dynactin p62是dynactin蛋白的3个组成部分之一，位于末端，生成的dynactin p62 siRNA能有效干扰外源基因的表达，同时dynactin p62能识别并连接ATP水解酶，并调节其活性。目前蜜蜂的dynactin p62基因的生物功能还不清楚。通过对中蜂dynactin p62基因的克隆和测序可以知道，其基因组DNA序列全长为2 403 bp，cDNA序列全长为1 491 bp，推测蛋白质序列为496个氨基酸，与西方蜜蜂dynactin p62的相似性88%[8]。

dynactin p62基因在不同发育时期中蜂均有表达，刚羽化雌性蜜蜂的表达量显著高于幼虫期，且工蜂的表达量显著高于蜂王；但dynactin p62基因在雄蜂中表达量没有明显的规律性。这提示dynactin p62基因可能与蜜蜂级型分化有关[8]。本研究首次研究了发育营养和空间因素对中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达影响，发现发育空间因素显著影响了中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达量，且是工蜂巢房中幼虫表达量高于王台中幼虫，这与以前研究结果一致[8]。同时发现营养因素没有显著影响中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达，这与Weaver 发现的前3.5天食物质量是幼虫级型分化关键时期相吻合[10]，但详细的分子机理还待进一步探讨。

[1] 曾志将.蜜蜂生物学[M].北京：中国农业出版社，2007.

[2] Kucharski R，Maleszka J，Foret S，Maleszka R. Nutritional control of reproductive status in honeybees via DNA methylation[J].Science，2008，319：1827-1830.

[3] Spannhoff A，Kim YK，Raynal NJM，Gharibyan V，Su MB，Zhou YY，Li J，Castellano S，Sbardella，G，Issa JPJ. Histone deacetylase inhibitor activity in royal jelly might facilitate caste switching in bees[J]. EMBO reports，2011，12（3）：238-243.

[4] Kamakura M. Royalactin induces queen differentiation in honeybees[J]. Nature，2011，473：478- 483.

[5] Shi YY，Huang ZY，Zeng ZJ，Wang ZL，Wu XB，Yan WY.Diet and cell size both affect queen-worker differentiation through DNA Methylation in honey bees（Apis mellifera，Apidae）[J]. PloS ONE，2011，6（4）：e18808.

[6] 石元元，曾志将，吴小波，颜伟玉，王子龙. 人工注射 Dnmt3 siRNA对意大利蜜蜂雌蜂发育的影响[J]. 昆虫学报，2011，54（3）：272-278.

[7] 石元元，田柳青，张飞，刘俊峰，颜伟玉，曾志将. 蜂王浆对雌性蜜蜂幼虫dynactin p62甲基化影响[J]. 中国农业科学，2012，45（23）：4909-4915.

[8] 曾晶，潘其忠，王子龙，吴小波，颜伟玉，曾志将. 中华蜜蜂dynactin p62基因的克隆及不同发育阶段表达分析[J]. 昆虫学报，2012，55（10）：1132-1141.

[9] Huang Q，Kryger P，Le Conte Y，Moritz RF，. Survival and immune response of drones of a Nosemosis tolerant honey bee strain towards N. ceranae infections[J]. J. Invertebr. Pathol.，2012，109（3）：297-302.

[10] Weaver N.Physiology of caste determination[J]. Annu Rev Entomol，1966，11：79-102.