蜂胶中总黄酮提取及含量测定的条件研究

2013-07-25王大红陈明胜

中国蜂业 2013年3期

王大红陈明胜

（1.湖北武汉职业技术学院，武汉 430074；2. 湖北武汉名盛生物科技有限公司，武汉 430022）

蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂（树胶），混入其上腭腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。经过科学证实，蜂胶含有黄酮类化合物、酸、醇、酚、醛、酯、醚类以及萜烯类、甾类化合物和多种氨基酸、脂肪酸、酶类、维生素、多种微量元素等多种活性成分。近代研究证明，蜂胶所含有的丰富而独特的生物活性物质，使其具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能。黄酮类化合物是蜂胶中的主要活性成分，常用醇提法提取。本实验研究了乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度四个因素对蜂胶总黄酮提取率的影响，然后通过正交试验研究了蜂胶总黄酮提取的最优工艺条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蜂胶：由武汉名盛生物科技有限公司提供。

1.2 试剂

芦丁对照品（纯度92.5%）、95%乙醇、无水乙醇、10%Al（NO3）3溶液、5%NaNO2溶液、10%NaOH溶液。

1.3 仪器

紫外可见分光光度计、恒温水浴锅、抽滤装置、冷凝回流装置、电子分析天平、100 ml量筒、50 ml容量瓶、100 ml容量瓶、吸量管、烧杯、铁架台。

1.4 实验方法

1.4.1 蜂胶总黄酮的提取工艺

取3.0 g蜂胶粉，加入75%乙醇水溶液90 ml，在50℃水浴下浸泡提取4 h，浸出蜂胶黄酮后，取出静置，冷却后将溶液过滤，滤液备用。

1.4.2 蜂胶提取液中总黄酮含量的测定

准确吸取蜂胶提取液2 ml，稀释至10 ml，再吸取稀释液1 ml，置于50 ml容量瓶中，加5%NaNO2溶液2 ml，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液2 ml，放置6 min，再加入10%NaOH溶液12 ml，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min，在508 nm波长处测定吸光度。以芦丁为标准品测定标准曲线，求回归方程，计算蜂胶提取液中总黄酮含量。

1.4.3 蜂胶总黄酮提取率的计算

2 结果与讨论

2.1 蜂胶总黄酮的测定方法

2.1.1 芦丁标准溶液的制备

精确称取芦丁标准品0.02 g，用少量乙醇溶解后定量转移到100 ml容量瓶中，用无水乙醇定容，得到浓度为0.185 mg/ml的芦丁标准使用液，置于棕色瓶中待用。

2.1.2 芦丁标准溶液最大吸收波长的测定

精确吸取0.185 mg/ml的芦丁标准使用液12 ml于50 ml容量瓶中，加5%NaNO2溶液2 ml，放置6 min，然后加入10% Al（NO3）3溶液2ml，放置6 min，再加入10%NaOH溶液12 ml，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。以不加芦丁标准液的空白试剂为参比，在波长480-530 nm范围内，每隔5 nm测定一次吸光度，在最大吸收峰附近每隔2 nm测定一次吸光度。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制吸收曲线，如图1所示。从图1看出芦丁标准溶液在508 nm有最大吸光度，所以实验选择波长508 nm处进行测定。

图1 芦丁标准溶液吸收曲线

2.1.3 标准曲线的绘制

准确吸取0.185 mg/ml的芦丁标准使用液0.00，4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、14.00、16.00 ml，分别置于50 ml容量瓶中，分别加5%NaNO2溶液2 ml，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液2 ml，放置6 min，再加入10%NaOH溶液12 ml，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min，在波长508 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，如图2所示。根据测定结果，得到线性回归方程为：A=12.475X+0.0054，r=0.9992。结果表明在芦丁浓度在0.0147-0.0592mg/ml范围内呈良好线性。

图2 芦丁标准溶液标准曲线

2.2 不同提取条件对蜂胶中总黄酮提取率的影响

2.2.1 乙醇浓度对蜂胶总黄酮提取率的影响

取3.0 g蜂胶粉末5份，分别加人60%、70%、75%、80%、90%的乙醇水溶液各60ml，在50℃水浴下浸泡提取4h，浸出蜂胶黄酮后，取出静置，冷却后将溶液分别过滤，量取滤液体积，测定蜂胶黄酮提取率，如图3所示。由图3中可以看出随着乙醇浓度的增加总黄酮的提取率先增加后减少，因此选择提取浓度75%-85%为宜。

图3 乙醇浓度对蜂胶总黄酮提取率的影响

2.2.2 固液比对蜂胶总黄酮提取率的影响

取3.0 g蜂胶粉末5份，分别加入1：20、1：25、1：30、l：35、1：40ml的65%乙醇水溶液，在50 ℃水浴下浸泡提取4h，浸出蜂胶黄酮后，取出静置，冷却后将溶液分别过滤，取过滤液量体积后，测定蜂胶黄酮提取率，如图4所示。由图4可以看出随着固液比的增加总黄酮的提取含量先增加后减少，因此选择固液比1：25-1：37为宜。

2.2.3 温度对蜂胶总黄酮提取率的影响

取3.0g蜂胶粉末5份，加入65%乙醇水溶液60 ml，分别在30、40、50、60、70℃水浴下浸泡提取4 h，浸出蜂胶黄酮后，取出静置，冷却后将溶液分别过滤，取过滤液量体积后测定蜂胶总黄酮提取率，如图5所示。由图5可以看出随着温度的升高总黄酮的提取量先增加后减少，再增加后减少，因此提取温度选择在30-60℃为宜。

图4 固液比对蜂胶总黄酮提取率的影响

图5 温度对蜂胶总黄酮提取率的影响

2.2.4 提取时间对蜂胶总黄酮提取率的影响

取3.0g蜂胶粉末5份，加入65%乙醇水溶液60 ml，在50℃水浴下分别浸泡提取2、3、4、5、6 h，取出静置，冷却后将溶液分别过滤，取过滤液量取体积后测定蜂胶总黄酮提取率，如图6所示。由图6可以看出随着时间的增加总黄酮的提取量先增加后减少，再增加后减少，因此提取温度选择在3-6 h为宜。

图6 提取时间对蜂胶总黄酮提取率的影响

2.3 蜂胶总黄酮提取条件的确定

为了确定乙醇浸提法提取蜂胶总黄酮的最佳工艺，设计四因素三水平正交试验对料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度4个因素进行考察，根据预试验的结果确定正交试验各因素的水平如表1所示。正交试验结果如表2所示。

表1 乙醇浸提法正交试验的因素与水平

表2 乙醇浸提法正交试验的直观分析结果

由表2可知，各因素对蜂胶总黄酮提取率的影响大小依次为：提取温度>乙醇浓度>料液比>提取时间。极差分析结果表明，提取温度对提取率有显著影响，而提取时间对提取率的影响最不显著。通过正交试验的极差分析，得到最佳工艺条件为A2B3C1D1，即料液比1：30、提取温度50℃、提取时间4h、乙醇浓度75%。在此最佳条件下，蜂胶总黄酮的提取率为27%。