范少敏 郭 琳 张 旋 刘 超 王 珊 杨新杰 宋小妹 陕西中医学院（咸阳712046）

芪珠升白口服液是多年临床应用经验方，由珠子参、黄芪两味中药组成，具有提高机体免疫力、升高白细胞数的作用，用于放化疗所致的白细胞减少症的治疗。现代研究表明，芪珠升白口服液富含多糖和皂苷，而且是其主要有效成分。因此，该实验采用L9（34）正交实验设计方案，分别以葡萄糖、竹节参皂苷IVa为对照品，以制剂中总多糖和总皂苷的含量及得率为评价标准［1，2］，对该制剂的提取纯化条件进行优化，为该制剂的工业化生产提供科学依据。

1 仪器、试剂及药材

1.1 仪器 RE－52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），UV1102紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），GB－204电子天平（瑞士梅特勒拖利多），SHD－3循环水多用真空泵郑州杜甫仪器厂。

1.2 试剂 蒽酮、硫酸、香草醛、冰醋酸、无水乙醇、高氯酸、正丁醇。

1.3 药材及对照品 珠子参药材、黄芪药材，购自陕西省西安市万寿路药材市场。竹节参皂苷IVa对照品（自制，经1HNMR、13CNMR、HMBC、HMQC及HR－MS确定结构，面积归一法计算含量均大于98%）；葡萄糖对照品（批号：110833－200503）。

2 方法及结果

2.1 总皂苷含量测定方法建立

2.1.1对照品溶液制备：精密称取竹节参皂苷IVa对照品10mg，用甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，即得浓度为1mg／mL的竹节参皂苷IVa对照品溶液。

2.1.2 测定波长的选择：准确吸取上述对照品溶液0.1mL于10mL具塞试管中，精密加入新配制的50g／L 的香草醛－冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，摇匀，置60 ℃水浴加热15 min，冰水冷却2min，精密加入冰醋酸5mL，摇匀，随行试剂做空白，用紫外分光光度计在700nm～400nm 波长范围内进行全程扫描，最大吸收波长在560nm 左右，故选择560nm 为测定波长。

2.1.3 标准曲线的绘制：精密吸取竹节参皂苷IVa对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL，分别置于具塞试管中，挥尽溶剂。参照上述2.1.2项下方法，于560nm测定吸光度（Abs），以竹节参皂苷IVa含量为横坐标（X），吸光度Abs）为纵坐标（Y）绘制标准曲线。竹节参皂苷IVa对照品在100μg～600μg 范围内线性关系良好，回归方程为Y＝0.0563X＋0.0001，r＝0.9991。

2.2 总多糖含量测定方法建立

2.2.1葡萄糖对照品溶液制备：将葡萄糖对照品于60℃烘1h，再逐渐升温至105℃干燥至恒重。精密称取葡萄糖对照品33mg，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含无水葡萄糖0.33mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 测定波长的选择：准确移取对照品溶液0.1mL 于10mL具塞试管中，用蒸馏水定容，取2mL 于10mL的具塞试管中，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮－硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温10min，取出，冰水浴冷却10min，取出，以相应试剂为空白，紫外分光光度计在800nm～400nm 范围全程扫描，结果显示在620nm 左右有最大吸收，故确定620nm 为测定波长。

2.2.3 标准曲线的绘制［3，4］：精密吸取标准溶液0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL分别置于10mL量瓶中，用蒸馏水定容，分别取2mL 于10mL 的具塞试管中，参照2.2.2项下方法，于620nm 波长处测定吸光度。以吸光度（Abs）为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。葡萄糖在33μg～198μg范围内呈良好线性关系，回归方程为Y＝0.0265X－0.0011，r＝0.9995。

2.3 提取工艺条件优化研究

2.3.1正交试验因素水平设计：多糖和皂苷为该复方制剂的主要有效成分。根据文献报道［1，2］，影响皂苷、多糖提取的主要因素有提取时间、提取次数、溶剂体积，因此，在预实验的基础上，以总多糖和总皂苷的含量为评价指标，采用L9（34）正交试验方案对其提取工艺进行优选，因素水平见表1。

表1 因素水平表正交试验方案结果见表2 。

2.3.2供试品溶液制备：取处方量药材粉末12g，共9份。按上述正交表方案组合进行提取，浓缩，使各组药液至50mL，即为各样品溶液。

2.3.2.1多糖供试品溶液的制备：精密量取上述各样品溶液30mL，加无水乙醇80mL，摇匀，离心，分离沉淀，沉淀用热水溶解，冷却，定容至100mL，摇匀，即得。

2.3.2.2 皂苷供试液的制备：精密上述各样品溶液量取制剂20mL，以水饱和的正丁醇50mL 萃取两次（25，25mL），萃取液合并，蒸干，精密加甲醇10mL溶解残渣，摇匀，即得。

2.3.3 样品含量测定［3］

2.3.3.1 多糖含量测定：精密吸取多糖供试品1mL 于10mL具塞试管中，加水2mL，摇匀，缓滴加0.2%蒽酮－硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置60℃水浴中保温10min，取出，立即置冰水浴中冷却10min，取出，以相应试剂为空白，在620nm 处测定吸光度。从多糖标准曲线计算多糖量，结果见表2。

2.3.3.2 总皂苷含量测定：取样品溶液0.2mL 至10mL 的量瓶中，用甲醇定容至刻度，取0.5mL 至具塞试管中，在水浴中挥尽溶剂，立即取出，放冷，参照上述2.1.2 项下方法，在560nm 处测定吸光度。据皂苷标准曲线计算皂苷量，见表2。

表2 正交试验方案及结果统计表

表3 多糖含量方差分析

表4 总皂苷含量方差分析

2.3.4 提取工艺的确定

2.3.4.1综合表2、表3的分析结果，影响多糖指标的因素大小顺序为C＞A＞D＞B，且C 因素有显著性差异，A 因素K值大小顺序为K2＞K3＞K1，B 因素K 值大小顺序为K2＞K3＞K1，C因素K 值大小顺序为K3＞K2＞K1，综合考虑，为达到指标合理且除去杂质，从多糖指标得到的最优工艺组合为A2B2C3。

2.3.4.2 根据表2的正交实验结果及表4的皂苷指标方差分析数据，影响皂苷指标的因素大小顺序为B＞A＞C＞D，但均无显著性差异，A 因素K 值大小顺序为K3＞K2＞K1，B 因素大小顺序为K2＞K3＞K1，C 因素大小顺序为K2＞K3＞K1，从皂苷指标得到的最佳工艺组合为A3B2C2。

1.3.4.3 综合对多糖和皂苷指标值及方差的分析，以及考虑到实际生产，得该口服液的最佳生产提取工艺为A2B2C3，即加8倍量水回流提取3次，每次1.5h。

2.4 验证性实验 按处方量分别取黄芪，珠子参各三份，按照优选的最佳工艺即8倍量水，回流提取3次，每次1.5h进行提取，使各组药液浓缩到50mL，按以上方法分别测定三组样品的总多糖和总皂苷含量，结果见表5。

表5 验证性实验结果

由表5可知，此方法稳定可靠，可以作为芪珠升白口服液的提取工艺。

3 讨 论 中药的提取效果直接关系到制剂的质量和疗效，选择合理的提取工艺是工业化大生产的前提和保障，合理的提取工艺评价指标是提取的有效成分质量的代表，也是提取物临床作用和疗效的体现。目前，用提取物中成分含量评价提取效果应用较多，此法量化程度高、易于操作，且具有耗资少的优点。本文分别以葡萄糖、竹节参皂苷IVa为对照品，以制剂总皂苷和总多糖的含量及得率为评价指标，将二者综合考虑作为工艺优化的指标。

［1］ 王淑萍，李晓静，张桂珍.黄芪多糖提取分离纯化工艺的优化研究［J］.分子科学学报，2008，24（1）：60－64.

［2］ 高培红，曹军毅，宋小妹.正交实验法优选珠子参总皂苷的提取工艺［J］.陕西中医学院学报，2006，29（2）：66－68.

［3］ 王小平，王 进，陈建章.建昌帮与樟树帮、中国药典法炮制的熟地黄中多糖含量比较［J］.陕西中医，2009，30（8）：1066－1067.

［4］ 王春燕，潘卫三，杨建春，等.正交实验法优选复方参芪软胶囊的提取工艺［J］.中国药师，2009，12（9）：1320－1321.