王晓晨 ，兰永辉，张小平，刘人源

（1华南理工大学环境科学与工程学院，工业聚集区污染控制与生态修复教育部重点实验室，广东 广州 510006；2东江环保股份有限公司，广东 深圳 518057，3梅州环保设备有限公司，广东 梅州 514700）

随着经济的发展，人类对能源的要求越来越高，微藻被认为是制备生物柴油燃料的理想原料。藻具有光合效率高、零净碳值、易培养、生长周期短、油烃含量高等优点，且不与农争地，不与人争粮 ，不影响全球能源分配，其作为生物能源，已引起各国政府和学者的高度关注[1]。微藻制备生物柴油的研究工艺包括产油微藻的筛选、微藻培养系统、微藻的收集分离、藻油的提取、微藻油脂制取生物柴油等过程。陈国等[2]对含油微藻制备生物柴油的工艺过程做了相关阐述。其中微藻油脂含量的测定是研究和开发高产油微藻的关键环节。

测定微藻藻油的方法有多种,包括有机溶剂提取法、索氏提取法、尼罗红荧光染料测定法、苏丹黑染色法、超临界 CO2提取法和离子液体提取法等[3]。选择一个快速、简便、高效、灵敏的测定方法就成了一个研究重点。本实验在以上方法的基础上，对溶剂提取-尼罗红荧光光谱法和溶剂提取-水浴蒸干称重法进行了比较研究，结果表明溶剂提取-尼罗红荧光光谱法有一定优势。

1 材料与方法

1.1 主要材料

藻种：①蛋白核小球藻（Chlorella Pyrenoidosa），由华南理工大学食品学院提供；②丝状藻（显微镜观察），广州大学城华南理工大学池塘打捞。

试剂：0.1 mol/LPBS缓冲溶液（pH= 7.4），二甲基亚砜（DMSO）（CP），1 g/L尼罗红母液（将100 mg尼罗红溶于100 mL丙酮中），10 g/L三油精（取1 g三油精溶于100 mL异丙醇中），正己烷（CP），2 mol/L KOH-CH3OH 溶液，2 mol/L HCl-CH3OH溶液。

尼罗红（Nile Red），99%，由百灵威提供；三油精（三油酸甘油酯），CP，由阿拉丁提供。

仪器：JA2003N型电子天平，XSP-2CA型显微镜，80-2型离心机， L-4500型荧光分光光度计， 721N型可见分光光度计等，DKS-24电热恒温水浴锅，SFG-02.500电热恒温鼓风干燥箱，GP-01光照培养箱。

1.2 实验方法

1.2.1 藻株培养

朱氏十号培养液的配制：纯水1000 mL，硝酸钙0.04 g，磷酸氢二钾0.01g，硫酸镁0.025 g，碳酸钠0.02 g，硅酸钠0.025 g，氯化铁0.008 g。使用时按1倍浓度使用，不进行稀释。

用250 mL的锥形瓶装200 mL朱氏十号培养液， 取少量蛋白核小球藻接种，瓶口以8层纱布封口后置光照培养箱中培养[温度（25±0.5）℃，光照强度4000 lx，光暗比12h∶12h]。 定期振摇锥形瓶，以防止藻细胞沉淀堆积。

1.2.2 藻液细胞密度与吸光度关系的测定

取浓缩的蛋白核小球藻，用PBS清洗，然后稀释成一定的密度梯度，以PBS缓冲液为空白，利用721N可见光分光光度计测其吸光度，同时用血球计数板进行显微计数（每个藻样重复计数3次，取平均数）对吸光度与相应的细胞个数进行回归分析。

1.2.3 藻细胞干重与吸光度关系的测定

取PBS清洗过的蛋白核小球藻，按倍数稀释成6个浓度梯度，分别测定6个浓度下的吸光度，每个样取20 mL，过滤，干燥箱中45 ℃干燥，称重。绘制藻细胞干重与吸光度关系曲线，并并回归分析。

1.2.4 微藻油脂与荧光强度关系曲线的绘制

用标准加入法[5]测定微藻中油脂的绝对含量，取一个生长至对数末期的藻样，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用PBS缓冲溶液清洗，然后稀释成一定浓度的藻液（吸光度一般要求在0.500左右，最大不能超过1.000）。取5个30 mL试剂瓶，标号1～5号，分别加入藻液19.8 mL，不同浓度的三油精溶液（200 μL异丙醇，180 μL 异丙醇+20 μL 的三油精，160 μL 异丙醇+40 μL 的三油精，140 μL异丙醇+60 μL的三油精，120 μL异丙醇+80 μL的三油精）0.2 mL。根据藻液体积依次加入二甲基亚砜（加入后二甲基亚砜体积分数为 20%），尼罗红（加入后尼罗红浓度为0.3 μg/mL），染色20 min后测定荧光强度（激发波波长488 nm，发散光范围400～700 nm，狭缝宽度均为10 nm，电压值400 V）[4-5]。

1.2.5 油脂的提取及测定

将打捞的藻浓缩干燥后，均取10 g放入两个250 mL锥形瓶中，各加入60 mL 2 mol/L的KOH-CH3OH，于75 ℃水浴加热10 min进行皂化。冷却至室温后再各加入120 mL 2 mol/L的HCl-CH3OH，于75 ℃水浴加热 10 min进行甲酯化。再次冷却至室温后加入60 mL正己烷，放置10 min，进行分层，取正己烷层。其中，一份在80℃水浴蒸除正己烷，得到粗油脂，称重，计算油脂的提取率；另一份取0.2 mL加入19.8 mL的藻样（1.2.4节中PBS稀释的一定浓度藻样）中，然后按1.2.4节方法测定荧光，每个实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 藻液细胞密度与吸光度的相关性

吕旭阳等[6]实验报道，在680 nm波长下测定小球藻藻液浓度，其灵敏度高、数据更精确。黄美玲等[7]也研究发现在540～700 nm 范围内蛋白核小球藻吸光值与细胞密度存在理想的线性关系， 线性系数r＞ 0.999，其中以 680 nm 波长处最为灵敏，其次为 540 nm。本工作以 680 nm处测得的吸光度OD680（X）为横坐标，以显微计数得到的细胞密度（Y）为纵坐标进行回归分析（图 1），得到藻的线性方程为Y=(10.935X)×109（R2=0.9991）。表明藻液吸光度与细胞密度呈显著正相关，说明藻液细胞密度可以用吸光度OD680来表示。

2.2 藻细胞干重与吸光度的相关性

黄美玲等[7]研究表明，小球藻吸光度和干重之间存在很好的线性关系。按照1.2.3节的方法，用相同体积不同浓度下藻细胞干重对吸光度进行回归分析，结果如图 2。由图 2可以看出，在吸光度为0.000～1.000之间时，藻干重和吸光度只见面有很好的线性关系，线性方程为Y=0.6738X–0.0327，相关性系数为R2=0.9995。吸光度大于1.000时，藻干重和吸光度之间的相关性显著降低。

2.3 不同培养条件下藻油脂的荧光特性分析

蛋白核小球藻的荧光强度和藻内油脂含量呈线性关系[5]。用荧光分光光度计在488 nm的激发波长处对各藻样做分析（方法见文献[8]），结果见图3。对各样的荧光峰值和加入的三油精浓度进行回归分析，结果见图4。从图4可以看出荧光峰值和加入的三油精浓度有较好的相关性，相关性系数为R2=0.9661，对应的回归方程为Y=0.2771X+6.9608。

图1 藻液细胞密度与吸光度的关系曲线

图2 藻干重和吸光度的关系曲线

同时，从直线和X轴的交点，可以得出藻内油脂三油酸当量含量为25.1mg/L。用于标准加入法的藻吸光度为0.567，根据藻密度和吸光度的线性关系Y=10.935X×109（R2=0.9991），计算得出相应的藻密度为6.20×109个/ L。再结合藻干重和吸光度的线性关系Y=0.6738X–0.0327（R2=0.9995），计算得出相应的藻干重 0.35g/L。因此就可以量化出单位蛋白核小球藻干重对应的三油精油脂当量含量，用于标准加入法的蛋白核小球藻油脂当量含量为72.5mg/g干藻。同时可以得出用培养箱培养的蛋白核小球藻藻油脂含量为 7.25%。说明通过建立藻密度、藻干重、藻液吸光度、荧光强度、油脂之间的关系，就可以得出藻体内油脂的积累量。荧光法测定微藻油脂含量是一个快速、简便、高效的方法[9-10]。

2.4 水浴干燥称重与荧光法测定结果比较

图3 各标样的荧光曲线

图4 油脂浓度和荧光峰值曲线

参考咸漠的碱法甲酯化方法[11]，对碱法甲酯化方法改进，实验使用碱法皂化加酸法甲酯化法处理微藻，结果发现处理过的微藻沉积物变成白色的，经显微镜观察破壁比较彻底，运用该法预处理微藻后，再用荧光测定油脂含量，可以使得油脂染色比较充分，避免了直接使用荧光尼罗红染色不够彻底的问题[7]。同时得到的微藻油脂含量比较接近真实值。另外，和超声或者 DMSO处理-尼罗红染色测荧光的方法[7]比较，溶液提取-荧光光谱法测定的是提取后的藻油，超声或者 DMSO处理-荧光法测定的是藻体。藻体养到一定时期后就需要及时测定，不能长期存放，若是实验失败，就需要重新养藻；而提取的藻油可以存放，实验测定失败，还可以再次配置测定。再者，当藻液浓度大时，直接用藻体测荧光容易受叶绿素荧光峰的干扰，而用藻油测荧光就可避免叶绿素峰的干扰。

收集经过KOH-CH3OH溶液及HCl-CH3OH溶液处理过的打捞藻，用正己烷提取后，一份用水浴蒸干，称重，3次平行试验分别得到0.766 g、0.814 g、0.871 g的粗油脂，取平均值为0.817 g，得油脂提取率为 8.17%；另一份用荧光法测定正己烷提取物的荧光强度3次，结果如图5，荧光峰值分别为54.06、55.83、55.75。根据标准加入法得出的油脂浓度和荧光峰值曲线关系Y=0.2771X+6.9608，分别计算得到油脂浓度为 16.997g/L、17.636 g/L、17.607 g/L，取平均值为17.413 g/L。60 mL正己烷中的油脂含量为 1.045 g，油脂提取百分率为10.45%。比较两种测量法得出，油脂含量测量结果比较接近，说明荧光法可以用于测定微藻提取物中的油脂含量；荧光法测定的数值比烘干称重法偏大，说明水浴干燥称重法在提取过程中某些油脂会蒸发损失；以及分离正己烷层时提取物的流失；加上正己烷为非极性有机物，强极性的藻油脂溶于正己烷的量很少或者不溶。所以最后提取的油脂含量比较低，略小于荧光法测得值，两种方法的测得值近似。每种有机溶剂对油脂的溶解度都有一个动态平衡，正己烷对处理藻的提取不够彻底，也会导致提取率比较低；另外荧光法测量油脂的灵敏度高，被测油脂含量可以在微克级与毫克级范围，而称重法测量误差大，如果提取油脂含量很低就可能测不出结果。

图5 捞藻正己烷提取物的荧光曲线

通过分析，当使用荧光法测定藻提取物中的油脂时，在一定体积一定浓度的藻液中加入一定量的藻提取物测荧光，同时测定藻液空白，通过藻密度、藻干重、吸光度、荧光峰值和油脂之间的关系，就可以得出单位藻干重中油脂的含量或藻提取物中的油脂量，并转化为油脂的提取率。

3 结 论

（1）藻密度与吸光度、藻干重与吸光度以及荧光峰值和油脂之间均有良好的线性的关系，分别为Y=10.935X×109（R2=0.9991）；Y=0.6738X–0.0327（R2=0.9995）；Y=0.2771X+6.9608（R2= 0.9661）。通过这3个线性关系可以得出微藻体内油脂的百分含量。用于内标法的微藻油脂含量经过3个关系计算，得出结果为7.25%。

（2）使用碱法皂化-酸法甲酯化处理微藻，再用荧光测定油脂含量，避免了直接使用尼罗红染色不够彻底的问题。同时得到的微藻油脂含量比较接近真实值。实验用打捞藻荧光测定值为10.45%，大于水浴干燥称重法测得值8.17%。

（3）荧光法测定微藻油脂含量是一个快速、简便、高效、灵敏的方法，既可以直接测定活藻细胞中的油脂，又可以测定经有机溶剂提取过的油脂。

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