张学慧

(赤峰工业职业技术学院，内蒙古 赤峰 024000)

刺槐素是一种天然黄酮化合物，通常存在于刺槐花、杭白菊及野菊花等植物中，具有抗氧化、抑菌及促进白血球吞噬等生物作用[1–2]，具有类似于维生素P 的功效，能解除平滑肌痉挛，降低皮肤、血管的通透性，抑制醛糖还原酶活性，从而减轻炎性病变[3]。NO 是一种信使分子，其主要机制是激活生物体内可溶性鸟苷酸环化酶，升高细胞内环鸟苷酸水平，从而产生各种生物活性。在胃肠道系统中，NO 发挥着与前列腺素(PGs)类似的作用，能抑制胃酸分泌，调节黏膜血流量，促进黏液分泌，调节生长因子及抑制白细胞的粘附，从而对胃肠粘膜起到保护作用[4–5]。NO 供体型非甾体抗炎化合物(NO–NSAIDs)是由阿司匹林、双氯芬酸等药物与外源性NO 供体(硝酸酯、亚硝酸酯等)通过中间链偶联得到的。这类化合物既保留了NSAIDs 的镇痛、抗炎作用，又具有NO 介导的胃肠道和心血管保护作用[6]。在这些研究的基础上，笔者以香叶木素为原料，通过多步反应，合成有机硝酸酯类NO 供体型刺槐素衍生物，并进行体外NO 释放测试，以确证其能否释放一定量的NO。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：Bruker–AVANCE500 核磁共振测试仪；美国Finnigan 液–质联用仪；X–4 数字显示显微熔点测定仪；ZF7 三用紫外分析仪。

主要试剂：香叶木素由陕西慈缘生物技术有限公司提供；DMF、氯苄、二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、丙酮等试剂均为分析纯或化学纯；无水溶剂通过4A 分子筛干燥后重蒸获得。

1.2 方 法

1.2.1 化合物O7-苯基香叶木素(2)的合成

参照文献[7–8]中的方法，在N2保护下，向香叶木素(3 g，10 mmol)的KHCO3(1.1 g，11 mmol)DMF (50 mL)溶液中加入氯苄(1.38 mL，12 mmol)，接着在125 °C下继续搅拌2.5 h后停止反应。冷却、过滤、浓缩，得到的固体，通过硅胶柱层析(二氯甲烷与甲醇的体积比为99︰1)分离纯化，得到黄色晶体2(2.46 g，收率63%)。1H NMR (d6–DMSO) δ (ppm) : 3.85 (s,3H,OCH3–4′),5.22 (s,2H,CH2of the benzylgroup) ，6.43 (s,1H,H–6)，6.77 (s,1H,H–3),6.83 (s,1H,H–8),7.07 (d,1H,J = 8.5 Hz,H–5′)，7.31–7.46 (m,6H,5H of the benzyl group and H–2′)，7.53 (d,1H，J= 8.5 Hz,H–6′) ，9.45 (s,1H,OH–3′),12.91 (s,1H,OH–5)。

1.2.2 化合物O7–苯基-O3′-苯四氮唑基香叶木素(3)的合成

在N2保护下，向化合物2(2.34 g，6 mmol)的KHCO3(0.6 g，6 mmol)DMF(30 mL)溶液中加入5–氯–1–苯基四氮唑(1.134 g，6.3 mmol)，升温至120 °C，继续搅拌1 h后停止反应。冷却、过滤、浓缩，得到的固体，通过硅胶柱层析(二氯甲烷与甲醇的体积比为98∶2)分离纯化，得到黄色固体粉末3(2.20 g，收率69 %)。1H NMR (CDCl3) δ (ppm) : 3.87 (s,3H,OCH3–4′),5.11 (s,2H,CH2of benzyl),6.43 (s,1H,H–6),6.52 (s,1H,H–3),6.56 (s,1H,H–8),7.13 (d,1H,J = 8.5 Hz,H–5′),7.35–7.87 (m,12H,5H of benzyl,5H of phenyltetrazole,H–2′ and H–6′),12.65 (s,1H,OH–5)。

Fig.1 Synthesis route of compound O7–nitrooxybutylacacetin

1.2.3 刺槐素(4)的合成

向化合物3(2.10 g，3.94 mmol)的甲醇溶液(100 mL)中加入甲酸铵(1.5 g，24 mmol)和10 %Pd/C(0.5 g)，在N2保护下回流2.5 h。反应停止后，冷却、过滤，分别用甲醇、四氢呋喃洗涤至滤液无色。滤液浓缩得到的固体，用甲醇重结晶得到纯的刺槐素4(0.728 g，收率65 %)。1H NMR (d6–DMSO) δ (ppm) : 3.86 (s,3H,OMe–4′),6.22 (d,1H,J=2.3 Hz,H–6),6.51 (d,1H,J=2.3 Hz,H–8),6.83 (s,1H,H–3),7.12 (m,2H,H–3′,5′),8.03 (m,2H,H–2′,6′),10.87 (s,1H,C7–OH),12.95 (s,1H,C5–OH)。

1.2.4 化合物O7-溴丁基刺槐素(5)的合成

向化合物4(0.568 g，2 mmol)的K2CO3(0.276 g，2 mmol)丙酮(60 mL)溶液中加入1,4–二溴丁烷(0.72 mL，6 mmol)，回流6 h后停止反应。反应液冷却、抽滤、浓缩，将得到的固体通过柱层析用二氯甲烷洗脱，获得黄色固体粉末5(0.635 g，收率76%)。1H NMR (CDCl3) δ(ppm)：1.86～2.02(m,4H,CH2CH2)，3.61～3.65 (t,2H,BrCH2),3.87 (s,3H,OMe–4′),4.06～4.09 (t,2H,CH2O),6.20 (d,1H,J=2.3 Hz,H–6),6.49 (d,1H,J=2.3 Hz,H–8),6.85 (s,1H,H–3),7.11 (m,2H,H–3′,5′),8.04 (m,2H,H–2′,6′),12.93 (s,1H,C5–OH)。

1.2.5 化合物O7-硝氧丁基刺槐素(6)的合成

向化合物5(0.418 g，1 mmol)的乙腈和四氢呋喃混合溶液中加入AgNO3(0.85 g，5 mmol)，在70 °C下避光反应2 h后停止反应。抽滤、浓缩滤液，将得到的固体通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯与石油醚的体积比为1︰3)纯化，获得浅黄色固体粉末6(0.277 g，收率69 %)。1H NMR (CDCl3) δ (ppm) : 1.87～2.03 (m,4H,CH2CH2),3.87 (s,3H,OMe–4′),4.06～4.09 (t,2H,CH2O),4.62 (s,2H,NO2OCH2),6.21 (d,1H,J=2.3 Hz,H–6),6.52 (d,1H,J=2.3 Hz,H–8),6.87 (s,1H,H–3),7.12 (m,2H,H–3′,5′),8.05 (m,2H,H–2′,6′),12.95 (s,1H,C5–OH)；MS (FAB+) m/z: 402 [M+1]+；m.p.：157～158℃。

1.3 目标化合物的体外NO 释放测试

1.3.1 Greiss 试剂的配制

氨苯磺胺4 g、N–萘乙烯二胺盐酸盐0.2 g和85%磷酸10 mL用蒸馏水稀释至100 mL。

1.3.2 亚硝酸钠含量标准曲线的绘制

参照文献[9]、[10]中的方法，配制0.01，0.03，0.05，0.07，0.09，0.20，0.40 μg/mL的亚硝酸盐系列标准溶液，分别取10 mL与Greiss 2.5 mL充分混匀，室温放置10 min后，于540 nm测定其光密度。获得线性回归方程y =2.389 8x + 0.001 1，R2=0.998 5，其中y代表光密度，x代表亚硝酸盐浓度(μg/ mL)。

1.3.3 目标化合物释放NO 能力的测试

将化合物6溶于0.01 mol/L二甲亚砜中，再用磷酸缓冲液稀释。缓冲液里含有过量的半胱氨酸(5 mmol/L)，混匀，受试物终浓度为10－4mol/L。将溶液置于37 °C水浴中反应1 h后，取反应液1 mL与Greiss试剂250 μL混合,室温放置10 min,于540 nm处测光密度。重复取2个样本测定，NO释放量以其相当于氧化产物–亚硝酸盐的量(μg/ mL)表示。

2 结果与分析

2.1 化合物O7–硝氧丁基刺槐素的制备结果

溴代物的硝酸酯化，通常是将硝酸银加入到无水乙腈中，然后加热至50 °C，再迅速加入溴代物，升温至70 °C反应一定时间后，就可以得到目标化合物[6]。本研究中采用该法合成目标化合物时，混合液反应8 h后通过TLC监测，也未发现目标产物的生成。经分析，认为可能是O7–溴丁基刺槐素在乙腈中的溶解度太小，无法完成反应，所以，加入其他溶剂来提高底物的溶解度，经尝试，加入适量的THF溶解溴代物后，再通过上述的方法可以合成化合物6。

2.2 目标化合物6 的结构

在化合物6的1H NMR谱图中，δ 7.12 ppm出现了1个芳氢的化学位移；在δ 1.87 ～ 2.03 ppm出现了4个氢的化学位移；在δ 4.62和δ 4.06～4.09分别出现了2个氢的化学位移。MS图中[M+1]+m/z为402，在误差允许范围之内，说明化合物为O7–硝氧丁基刺槐素。

2.3 目标化合物的体外NO 释放能力

因化合物6的NO体外释放测试通常用Greiss法，本研究中采用该方法，测得化合物6能在体外释放一定量的NO，其1 h时的释放量为0.369 μg/mL。这与已报道的类似化合物的NO释放能力相当[9]。

3 结 论

依照NO–NSAIDs设计思想，设计、合成了1个新的有机硝酸类NO供体型刺槐素衍生物6。用核磁、质谱对其结构进行鉴定，并进行相应的NO释放能力测试，结果表明其能释放一定量的NO。这为下一步的结构修饰提供了思路，也为进一步研究抗炎和抗血小板聚集准备了化合物。

感谢内蒙古大学为论文中的化合物进行了氢谱和质谱测试。

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