熊尧，谢英，张世湘，张列兵，罗云波，郝彦玲

(中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京100083)

0 引 言

细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽[1]。乳酸菌细菌素可分为四大类，其中IIa类细菌素因其对单核细胞增生李斯特菌有强烈的抑制作用，而成为天然防腐剂研究与开发的热点[2，3]。根据植物乳杆菌素LB-B1的理化性质及基因簇结构，确定其属于IIa类细菌素[4]。

大量研究表明：敏感菌株的甘露糖磷酸转移酶系统(EIItMan)是IIa细菌素发挥抑菌作用的受体[5-6]。包括IIAB、IIC和IID三个组分，IIAB位于细胞质，IIC和IID定位于细胞膜。利用异源表达实验表明：组分IIAB不参与IIa类细菌素的位点识别，组分IIC和组分IID是细菌素识别的靶点[7-10]。但异源表达存在的问题是不能克服异源宿主本身IID组分的干扰。本研究利用同源重组的方法将敏感菌株IID组分突变，为是否IID组分在IIa细菌素位点识别中发挥作用提供直接证据。

1 实 验

1.1 材料

(1)菌株及质粒。植物乳杆菌LB-B1和植物乳杆菌WQ0815由本实验室保存。大肠杆菌EC1000和质粒pORI28由荷兰格罗宁根大学Jan Kok教授惠赠，辅助质粒pTRK669由美国北卡罗来纳州立大学Klaenhammer教授惠赠。

(2)试剂。DNA Marker DL2000，T4-DNA连接酶,ExTaq DNA聚合酶，限制性内切酶，RNase A，卡那霉素，红霉素和氯霉素，DNA回收试剂盒，其他常规化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

(1)利用PCR扩增IID同源臂。根据植物乳杆菌ST-III(GenBank Acession No.CP002222.1)的IID序列，设计同源臂的引物，由上海生工生物技术有限公司合成，序列如下：

IID上游引物：5'-CGGGATCCATTGATGACG TTACG-3'

IID下游引物：5'-GCTCTAGACACATGCAGAG GAAGGTT-3'

在上游引物和下游引物的5'端分别加入BamH I和Xba I的酶切位点(下划线)。……