陈慧，徐琳瑜，钟晓怡，郜恒骏



双重免疫组化技术在乳腺癌组织芯片中的应用

陈慧，徐琳瑜，钟晓怡，郜恒骏

201203 上海芯超生物科技有限公司

在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品或同一种细胞中共存，最好使用双重染色法在同一个组织样本上进行杂交。双重染色的方法有两种类型，免疫酶组织化学和免疫荧光化学法。目前，在实体肿瘤中，由于甲醛固定石蜡包埋组织过高的荧光信号，免疫荧光法更适合用于冰冻保存的组织[1]。双重免疫酶组织化学需要选择不同显色底物、不同的抗体、不同修复方法进行搭配，操作繁琐，在科研使用比较广泛，但临床操作要求稳定性高、操作简单，所以在临床不常规使用。随着科技进步、技术发展，出现越来越多稳定性好、操作简单的试剂，可以解决上述问题。雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、C-erbB-2、E-钙黏蛋白（E-cadhein）、p53 这些抗体大都是经典的抗体，纯度高，定位准确，不会出现因为定位不准确或非特异性表达导致对结果的判读误导。而乳腺癌细胞胞浆丰富，呈嗜酸性，伴有多个核仁且明显，且成片生长较容易区分。本实验通过在乳腺癌上表达定位准确、位置单一的抗体进行免疫组化单染和双染的比较，看是否存在结果上的差异，以探讨在临床上进行双重免疫组化的可行性和操作的难易程度，从而达到在临床上广泛应用的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 32 例乳腺癌标本取自生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司组织库国家 863 项目协作医院近 2 年新鲜手术切除及存档标本，患者均为女性，年龄 33 ~ 93 岁，中位年龄 55岁；其中 II 级浸润性导管癌 8 例，III 级浸润性导管癌 24 例。全部病例术前均未作化疗或放疗。所有组织标本取出后迅速用 10% 中性甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋备用。

1.1.2 实验试剂与仪器 Polink DS-MR Kit for Double Staining Kit 购自 GBI 公司；抗体 ER、RMA-0501 即用型兔抗PR、RMA-0502 即用型兔抗 C-erbB-2、MAB-0198 即用型鼠抗购自福州迈新公司；抗体 E-cadhein、浓缩型兔抗/抗体p53 购自美国 Cell Signaling 公司；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）购自丹麦 Dako 公司；哈氏苏木素购自美国 Sigma 公司。

Aperio 图像成像分析系统为美国Aperio 公司产品；全自动染片机为德国 Lecia 公司产品；显微镜为日本 Nikon 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化单染 常规免疫组化操作步骤：①脱蜡、抗原修复、阻断：将组织芯片放入 65 ℃烘箱，烘蜡 1 h。片子烘烤完成后，放入全自动染色机中，进行脱蜡；以柠檬酸高压修复；将片子放入阻断剂中 10 min；②一抗室温 30 min：其中 ER、PR、C-erbB-2 是即用型抗体，E-cadhein 使用稀释度 1:600、p53 使用稀释度 1:50；③二抗、显色：滴加二抗工作液，孵育 30 min；在片子上滴加稀释后的 DAB，显色 5 min，自来水冲洗；④复染、封片：滴加哈氏苏木素复染 1 min 后在盐酸酒精中浸没2 s，用自来水冲洗，通风橱自然晾干后用中性树胶封片。

1.2.2 免疫组化双染 免疫组化双染操作步骤：①脱蜡、抗原修复、阻断：与免疫组化单染相同。②一抗、二抗和显色：若两个一抗来源不同种属（兔抗和鼠抗），将 p53 按 1:50 的稀释度用C-erbB-2 抗体稀释，室温 30 min 后，片子用 PBS 冲洗，滴加 HRP + AP 混合二抗，室温孵育 30 min；在片子上滴加稀释后的 DAB，显色 10 min，自来水冲洗；滴加快红的工作液在样本上，孵育 20 min，自来水冲洗。若两个一抗来源于同一种属（兔抗），加即用型 ER 或 PR 室温 30 min 后，片子用 PBS 冲洗，滴加 HRP 二抗工作液，孵育 30 min；在片子上滴加稀释后的 DAB，显色 10 min，自来水冲洗；滴加 GBI 的封闭液30 min， E-cadhein 稀释度 1:600，室温 30 min，加 AP 二抗工作液 30 min；滴加稀释后的快红，孵育20 min，自来水冲洗。③复染、封片：滴加哈氏苏木素复染 15 s，用自来水冲洗，将玻片放在 PBS 中直到出现蓝色，通风橱自然晾干后用中性树胶封片。

1.2.3 阴性对照 在免疫组化双染过程中加一张同一型号的组织芯片，用 PBS 替代一抗。

1.2.4 判断标准 根据参考文献[2]，C-erbB-2 阳性部位在细胞膜，结果判读标准为 0：无着色；l+：任何比例的浸润癌细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着色；2+：> 10%的浸润癌细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀的细胞膜棕黄着色或 < 30%的浸润癌细胞呈现强且完整的细胞膜棕褐着色；3+：> 30%的浸润癌细胞呈现强的、完整的细胞膜棕褐着色。p53、ER、PR 阳性部位在细胞核，E-cadhein阳性部位在细胞膜。结果判读标准：（–）即无阳性染色，此为 0 分；（±）即可疑阳性，此为1 分；（+）即弱阳性，此为 2 分；（++）即中等阳性，此为 3 分；（+++）即强阳性，此为 4 分；将阳性细胞百分比分 5 个等级。无阳性细胞为 0 分，阳性细胞≤25% 为 1 分，26% ~ 50% 为2 分，51% ~ 75% 为 3 分，> 75% 为 4 分。着色强度和数量积分相加，0 分是（–），2 ~ 3 分是（±），4 ~ 5 是（+），6 ~ 7（++），8 分是（+++）。其中（+）和（++）判断为阳性[3]。

1.3 统计学处理

应用 SPSS17.0 统计软件进行分析，数据资料采用2检验，α 取 0.05。

2 结果

因为免疫组化双染在同一张组织切片上表达不同的抗体，所以抗体之间的组合不能重叠。例如：p53、ER、PR 都是细胞核阳性表达，所以不能在同一张组织切片上表现，C-erbB-2 和 E-cadhein 是细胞膜阳性表达，也不能将该两个抗体组合。所以在本实验中，p53 和C-erbB-2 作为一组抗体，ER 和 E-cadhein 作为一组抗体，PR 和 E-cadhein 作为一组抗体进行实验。在免疫组化单染中，32 例乳腺浸润性导管癌中 ER、PR、p53、C-erbB-2、E-cadhein 的阳性率分别为 47%（15/32）、31%（10/32）、41%（13/32）、53%（17/32）、84%（27/32），而免疫组化双染 p53 和C-erbB-2相互组合，其中 p53 棕色表达在细胞核而C-erbB-2 红色表达在细胞膜（图 1）；p53/C-erbB-2、ER/E-cadhein、PR/E-cadhein 中单个抗体的阳性表达率分别是 37.5%（12/32）/53%（17/32），44%（14/32）/78%（25/32），28%（9/32）/78%（25/32）（表 1）。只有单个抗体表达的结果如图 2、图 3 所示，ER、PR、p53、C-erbB-2、E-cadhein 免疫组化单染和双染结果之间的值分别为 0.78、0.517、0.886、0.908、0.063，均大于 0.05，说明该两组数据之间没有差异，也就是说用免疫组化单染和免疫组化双染的实验结果没有差异。

3 讨论

肿瘤转移或诊断是一个多步骤的复杂过程，在实际病理诊断中，由于制片原因，在常规的 HE 染色中，肿瘤细胞与正常细胞无法区分[4]，有时候需要知道两种蛋白分子表达、转运或代谢的相关性[5]。免疫组化双染通过不同的显色系统可以很好地解决这些问题。常规标本的保存方法是甲醛固定石蜡包埋，具有可室温保存而不需特殊设备，保存时间久等特点。而因为石蜡切片的自发荧光的问题，不适用免疫荧光，而适用免疫组织化学法。以前免疫组化双染由于操作步骤繁琐、重复性差而只广泛应用于科研领域，在临床上应用较少。本实验通过 ER、PR、E-cadhein、C-erbB-2、p53 等几个定位清晰准确的抗体在乳腺癌上进行单染和双染表达，探讨其在临床上广泛应用的可行性。

图 1 p53 和 C-erbB-2 均表达的免疫组化双染和免疫组化单染结果图（A：免疫组化双染的阴性对照；B：免疫组化双染，p53 为核阳性，棕色显色；C-erbB-2 为膜阳性，红色显色；C：免疫组化单染，p53 为核阳性，棕色显色；D：免疫组化单染，C-erbB-2 为膜阳性，棕色显色）

表 1 免疫组化单染和双染的数据结果

注：ER 的免疫组化单染和双染的2= 1.390（= 0.78），PR 的免疫组化单染和双染的2= 2.277（= 0.517），p53 的免疫组化单染和双染的2= 0.644（= 0.886），C-erbB-2 的免疫组化单染和双染的2= 0.551（= 0.908），E-cadhein 的免疫组化单染和双染的2= 7.294（= 0.063）。

图 2 只有 p53 表达的免疫组化双染和免疫组化单染结果图（A：免疫组化双染，p53 为核阳性，棕色显色；C-erbB-2 不表达；B：免疫组化单染，p53 为核阳性，棕色显色；C：免疫组化单染，C-erbB-2 不表达）

图 3 只有 C-erbB-2 表达的免疫组化双染和免疫组化单染结果图（A：免疫组化双染，p53 不表达；C-erbB-2 膜阳性，染红色；B：免疫组化单染，p53不表达；C：免疫组化单染，C-erbB-2 为膜阳性，棕色显色）

和常规免疫组化相比，免疫组化双染在原理上是相同的，都是利用抗原与抗体间的特异性结合原理和特殊的标记技术，对组织和细胞内的特定抗原或抗体进行定位、定性或定量检测[6]。作为免疫酶组织化学标记物的酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定性和定位研究。从理论上讲。用细胞化学方法能显示的酶均可用于免疫酶组织化学标记物，但实际上能用于免疫组织化学技术的酶并不多。通常是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）。辣根过氧化物酶广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，它的分子量约 40 kD，稳定性好，其底物为过氧化物和供氢体，可以结合 DAB、3-氨基-9-乙基咔唑（3-amino-9-ethylcarbozole，AEC）。AEC 形成红色不溶性产物，但易溶于有机溶剂。DAB 是无色还原型染料，能被氧化生成不溶于水且不易褪色的棕色氧化性染料，所以实验室最常使用的是 DAB。碱性磷酸酶系小牛肠黏膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，它通常结合的显色基团有四唑氮蓝（nitro-blue-tetrazolium，NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl- phosphate，BCIP）、AP-Red、快红（Fast-Red）。其中 AP-Red 和快红均在反应位点产生红色沉淀，但都易溶于酒精，在临床没有广泛使用。NBT/BCIP 显微镜下可以由于 pH 值不同形成蓝色、紫色或棕色沉淀，是碱性磷酸酶显色的最好选择。根据本实验室之前经验来看，NBT/BCIP 的通常显色为棕色，这和 DAB 颜色很接近不容易区分，而且常需要 30 ℃孵育 1 ~ 2 h，实验操作时间太长，NBT/BCIP 染色组织样本室温放置长时间会出现蓝色沉淀，除非片子封片后马上扫描拍照存档，否则蓝色沉淀会影响实验结果的判读。也有文献报道，DAB 经 NBT/BCIP 作用后可转变为灰蓝色，易与 NBT/BCIP 的蓝色产物相混淆，降低对比度[7]；也有不少文献使用棕色和红色的颜色结合作为免疫组化双染的颜色结合[7-10]。我们最后选择快红，室温显色 20 min，染色完毕后，放入烘箱60 ℃ 1 h 或室温过夜直接用中性树脂封片，并未发现颜色减弱。

双重免疫组织化学染色的关键在于如果是同一种属来源的一抗，如何完全消除上一重染色中抗体及其复合物的活性，避免与下一重染色的抗体和复合物起交叉反应。以往，常常采用酸性溶液（如 pH 2.2 的甘氨酸-盐酸溶液）来洗脱前一种染色在切片上形成的抗原抗体复合物。但在实践中发现，此方法并不能完全消除交叉反应，而且酸洗还会破坏切片中组织抗原而影响下一重染色[11]。现在实验中，一抗的纯度很高，不同种属一抗混合孵育，不会造成非特异性染色，而同一种属的一抗通过封闭液也能很好地进行封闭，避免非特异性杂交。整个实验过程，如果是不同来源的一抗，比常规免疫组化只多了一步快红显色 20 min，而同一来源的一抗，也只比常规免疫组化多了 2 h。但是一张样本可以结合2 个抗体，减少一半以上的样本数量，也大大降低了工作量。此外，实验中可以减少抗体稀释液、PBS、苏木素等试剂的消耗。

将单染和双染结果进行对比，发现 32 例乳腺癌中两者在结果判定方面没有差别，所以说明双染法除了在一张芯片上检测 2 种抗原，显示不同颜色，而且还步骤简单，节约成本，比单染法更直观地进行对比，更利于病变的观察，提高诊断质量。因此，应用双重免疫组化技术在临床诊断上有十分广阔的前景。

[1] Shi SR, Shi Y, Taylor CR. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis. J Histochem Cytochem, 2011, 59(1):13-32.

[2] Guidelines for HER2 detection in breast cancer, the 2009 version. Chin J Pathol, 2009, 38(12): 836-840. (in Chinese)

乳腺癌HER2检测指南(2009版). 中华病理学杂志, 2009, 38(12): 836-840.

[3] Xu LZ, Yang WT. Criteria of the results of the immunohistochemical reaction. Chia Oncol, 1996, 6(4):229-231. (in Chinese)

许良中, 杨文涛. 免疫组织化学反应结果的判断标准. 中国癌症杂志, 1996, 6(4):229-231.

[4] Geng J, Ding YQ, Cai JJ, et al. Application of dual immunohistochemical staining in detection of lymphovascular space invasion of breast carcinoma. Chin J Diagn Pathol, 2008, 15(1):40-41, 46. (in Chinese)

耿舰, 丁彦青, 蔡俊杰, 等. 双重免疫组化染色在乳腺癌脉管浸润检测中的应用. 诊断病理学杂志, 2008, 15(1):40-41, 46.

[5] Gulubova MV. Structural examination of tryptase- and chymase-positive mast cells in livers, containing metastases from gastrointestinal cancers. Clin Exp Metastasis, 2003, 20(7):611-620.

[6] Yamashita H, Nishio M, Ando Y, et a1. Stat5 expression predicts response to endocrine therapy and improves survival in estrogen receptor-positive breast cancer. Endocr Relat Cancer, 2006, 13(3): 885-893.

[7] Huang Y, Wang KM, Kang AJ, et al. bFGF and ki-67 double immunohistochemical staining. Chin J Diagn Pathol, 2002, 9(3):187, 49. (in Chinese)

黄莺, 王康敏, 康安静, 等. bFGF与ki-67双重免疫组化染色法. 诊断病理学杂志, 2002, 9(3):187, 49.

[8] Wang YJ, Liu SZ, Wang H, et al. EMA and p53 immunohistochemical double staining. Chin J Diagn Pathol, 2005, 12(3):232, 58. (in Chinese)

王永军, 刘世正, 王珩, 等. EMA与p53免疫组化双重染色法. 诊断病理学杂志, 2005, 12(3):232, 58.

[9] Dai YM, Mei F, Kan CR. Double immunohistochemical staining in the detection of hepatocellular carcinoma and adjacent the intrahepatic AFP and HBsAg, IgG or albumin. Chin J Clin Exp Pathol, 1991, 7(2):146-148. (in Chinese)

戴益民, 梅峰, 侃灿荣. 双重免疫组化染色在检测肝癌及癌旁肝内AFP和HBsAg、IgG或自蛋白的应用. 临床与实验病理学杂志, 1991, 7(2):146-148.

[10] Huang ZX, Huang HM. Paraffin sections on Ki67 KP1 double immunohistochemistry notation. Chin J Clin Exp Pathol, 1995, 11(3): 242-243. (in Chinese)

黄中新, 黄华梅. 石蜡切片上Ki 67与KP 1的双重免疫组化标记法. 临床与实验病理学杂志, 1995, 11(3):242-243.

[11] Zhou HB, Wang L, Ma HH, et al. High-temperature high-pressure treatment in the cross-reactivity of the elimination of double immunohistochemical staining. Chin J Clin Exp Pathol, 2008, 24(2): 232-233. (in Chinese)

周航波, 王琳, 马恒辉, 等.高温高压处理在消除双重免疫组化染色交叉反应中的应用. 临床与实验病理学杂志, 2008, 24(2):232- 233.

郜恒骏，Email：hengjun_gao@shbiochip.com

2012-11-15

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.014