刘奇，尹磊淼，魏颖，王宇，徐玉东，冉君，杨永清



蛋白质磷酸化检测方法及原理

刘奇，尹磊淼，魏颖，王宇，徐玉东，冉君，杨永清

200030 上海中医药大学上海市针灸经络研究所

蛋白质是生命活动的物质基础，是机体细胞的重要组成部分。新生蛋白质多肽需要经过翻译后修饰才能转变为成熟蛋白质。翻译后修饰包括：甲基化、羟基化、羧基化、糖基化、脂酰化、异戊烯基化等共价修饰[1]。蛋白质磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，在蛋白激酶催化作用下，磷酸基团由供体分子转移到蛋白质的含有羟基的氨基酸侧链上，具有可逆性[2]。蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的全部过程，文献显示在任何时间内真核细胞蛋白分子中约有 1/3 的数量在发生磷酸化[3]，主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上，较少见的磷酸化氨基酸还有精氨酸、组氨酸、赖氨酸以及天冬氨酸和谷氨酸等。蛋白质磷酸化氨基酸有 4 种类型：①氧-磷酸盐，通过羟氨基酸的磷酸化形成；②氮-磷酸盐，通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成；③酰基磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；④硫-磷酸盐，通过半胱氨酸磷酸化形成[4]。

鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对生命活动的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容，用蛋白组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰状态及其变化，其中磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是蛋白质组学研究的关键技术之一。

1 常用蛋白磷酸化检测方法及原理

1.1 32P 同位素放射性标记法

蛋白质磷酸化可以通过识别电泳凝胶上的同位素蛋白点来检测。用32P 同位素放射性标记法，即体内代谢培养用32P 同位素放射性标记磷酸盐作为磷酸基团供体，经过磷酸化酶促反应，带有32P 同位素放射性标记的磷酸基团则转移到相应的反应蛋白上，通过凝胶电泳分离，可以用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。但放射性标记只能在细胞中应用，比较局限且有放射性危险。

Arrigo 和 Michel[5]采用32P 同位素放射性代谢标记和凝胶电泳分析法，观察了在耐热处理后再经热刺激和肿瘤坏死因子刺激的热休克蛋白 HSP28 磷酸化程度的改变。Aponte 等[6]描述了原位32P 同位素放射性标记完整线粒体基质蛋白的具体方法，并通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳观察了 40 多种蛋白质磷酸化的动态过程，而32P 同位素放射性脉冲追踪进一步揭示了蛋白质磷酸化位点的交替，以及磷酸化蛋白质成员的变化，该方法不仅显示了线粒体基质磷酸化的丰富，而且有可能提供有生物学意义的确切的磷酸化位点。Sarkar 等[7]进行了甲状腺激素对成年大鼠脑突触蛋白磷酸化作用中钙调蛋白的研究。结果显示：与钙离子和钙调蛋白所致的磷酸化基础水平相比，32P 同位素放射性标记的突触磷酸化蛋白在 L-甲状腺素（L-T3）作用下显著增多，使用乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）可以明显抑制甲状腺激素所致钙离子和钙调蛋白产生的磷酸化影响，提示高比例的 L-T3 所致成年大鼠大脑皮层突触蛋白磷酸化依赖钙及钙调蛋白的参与。El-Benna 和 Dang[8]分析了人中性粒细胞内的蛋白磷酸化，应用32P 同位素放射性标记，在刺激中性粒细胞蛋白发生磷酸化之前给细胞内 ATP 加入32P 同位素放射性标签，激发磷酸化后从细胞中提取蛋白，经显影观察分析中性粒细胞蛋白的磷酸化。

1.2 Western blot 蛋白免疫印迹

蛋白质磷酸化作用可以通过 Western blot 利用抗磷酸化蛋白抗体进行检测。Western blot 特异性好、分辨率高，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以一抗为探针，结合标记的二抗并以自显影或者底物显色来显示蛋白条带。凝胶由上层的浓缩胶和下层的分离胶组成。蛋白样品经过浓缩胶和分离胶后会以清晰的印迹按分子量大小依次上下排列于胶面上，然后将蛋白转移至 PVDF 膜（聚偏氟乙烯膜）或 NC 膜（硝酸纤维素膜），蛋白会以非共价键的形式稳固地结合在载体上，选择对应的磷酸化抗体，发生抗原抗体反应，再与酶或同位素标记的二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性磷酸化蛋白成分。但细胞中的磷酸化信号通常比较弱，需要经过磷酸化富集后 Western blot 才能检测到，并且由于分析和制备不能用同一块胶，有时检出的蛋白点与胶上的蛋白点很难对应，不利于精确分析[9]。

Kim 等[10]比较了热休克状态和耐热状态下细胞磷酸化蛋白的差异表达，共检测出 93 种胞内蛋白有明显磷酸化改变，并通过 Western blot、质谱等技术识别出 81 种磷酸化蛋白。Warters 等[11]通过 Western blot 检测射线照射后早期黑素瘤细胞中全部的磷酸化蛋白质，找出了区别于纤维母细胞中的异常磷酸化蛋白。Ptak 和 Gregoraszczuk[12]研究了双酚 A（BPA）对卵巢癌上皮细胞 OVCAR-3 瘦蛋白及其受体表达的影响，通过 Western blot 检测评价了 BPA、瘦蛋白以及两者共同对 OVCAR-3 增殖作用中介导 JAK/STAT、MAPK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路磷酸化蛋白活性状态，结果提示，BPA 诱导瘦素受体表达提供更多的瘦素蛋白结合位点，通过 JAK/STAT、MAPK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路传递增殖信息。刘伦华等[13]研究了磷脂酰肌醇-3-激酶（PBK）分别在胰岛素所激活 MAPK 通路磷酸化和表皮生长因子（EGF）所激活 MAPK 通路磷酸化中的作用，应用 Western blot 分析 MAPK 磷酸化通路中磷酸化蛋白水平，结果提示 PBK 在胰岛素和 EGF 刺激的 MAPK 磷酸化信号通路中起不同的作用。吉非替尼和埃罗替尼是常用肺癌表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂的临床代表药，韩瑞丽等[14]进行了该药在人非小细胞癌（NSCLC）EGFR 突变系细胞 H1650 中耐药机制的研究，通过 Western blot 检测 EGFR 下游 Ras/Raf/MEK/ERK 通路和 PI3K/AKT 通路中 P-AKT 和 P-ERK 蛋白的含量，结果提示：H1650 细胞系对埃罗替尼相对耐药可能与 AKT 信号传导通路异常活化有关，而与 Ras/Raf/MEK/ERK 信号途径无关。

Ferlin 等[15]以人成骨细胞中胰岛素样因子 3（INSL3）为分析对象，通过Western blot 检测发现 MAPK 是 INSL3 诱导信号通路的主要途径，并且证实 INSL3 可以调节不同成骨细胞标志物的表达，提示在骨细胞代谢中，INSL3/RXFP2 系统通过 MAPK 级联反应刺激成骨细胞重要基因的转录。Calegari 等[16]研究运动对大鼠胰岛细胞的生长和凋亡标记水平的影响，分别提取耐力训练或久坐的对照组大鼠胰岛组织细胞，通过 Western blot 检测分析发现，耐力训练可能通过激活 AKT 信号通路增加胰岛 β 细胞抗氧化能力，减低氧化产物和凋亡蛋白含量，延长生存时间。刘蔚然和岳云[17]探讨异氟烷麻醉对术后老龄大鼠海马 Tau 蛋白表达的影响，通过 Western blot 检测海马总 Tau 蛋白、磷酸化 Tau 蛋白及蛋白磷脂酶的含量变化，结果表明在正常体温下，异氟烷并不能诱发 Tau 蛋白的过度磷酸化，提示异氟烷麻醉诱导的老龄大鼠认知功能障碍可能与 Tau 蛋白磷酸化无关。

1.3 荧光染色法

Pro-Q Diamond dye 是 Molecular Probes 公司开发的一种荧光染色试剂，主要用于信号转导中蛋白磷酸化的研究，可以直接用来染色磷酸化蛋白凝胶，检测磷酸化位点中的酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸的磷酸化而无需加入抗体，同时该染料还与质谱兼容，而且不妨碍随后蛋白质组中多种磷酸化分析研究[18]。Pro-Q Diamond dye 对高丰度且磷酸基团转化速率低的蛋白质具有较高的灵敏度，但对于不同的磷酸化位点，Pro-Q Diamond dye 的灵敏度差异较大。

Orsatti 等[19]联合运用二维电泳和 Pro-Q Diamond dye 染色方法，以过度表达蛋白酪氨酸磷酸酶 PRL-3 的高度侵袭性结肠癌细胞 HCT116 为模型，通过 Pro-Q Diamond dye 检验芯片，成功检测出 PRL-3 的两种目标蛋白——细胞骨架蛋白 ezrin 和延伸因子 2 有明显的去磷酸化。阿尔茨海默病的特征标志之一是海马区存在神经元纤维缠结，该结由异常过度磷酸化Tau 蛋白组成，Di Domenico 等[20]用Pro-Q Diamond dye 染色方法测量海马区整体磷酸化蛋白的改变，发现 17 种涉及神经元能量代谢和信号传导通路的异常磷酸化蛋白有明显改变。

Liu 等[21]应用双向凝胶电泳和 Pro-Q Diamond dye 染色技术对人体张氏肝脏细胞总蛋白进行了分离，结果共鉴定出 269 个磷酸化蛋白。据此，Liu 等推测，双向凝胶电泳结合 Pro-Q Diamond dye 染色方法可以检测全部磷酸化蛋白。Ding 等[22]分析了运动对大鼠海马区能量代谢和神经可塑性相关蛋白的影响。针对多种蛋白翻译后修饰及表达类型，通过 Western blot 和 Pro-Q Diamond dye 染色观察发现，神经细丝蛋白轻链多肽、胶质纤维酸性蛋白、热休克蛋白 8 和 Pur-α 转录激活蛋白磷酸化明显增高，全部上调蛋白中大多数涉及认知功能，提示运动增强能量代谢和突触可塑性从而促进大脑健康。Schulenberg 等[23]应用蔗糖密度梯度分离和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，通过 Pro-Q Diamond dye 分析了牛心脏线粒体蛋白磷酸化稳态，成功得到肽质量指纹图谱，并能区分相同磷酸多肽不同亚型之间的磷酸化。

1.4 流式细胞技术

流式细胞技术采用荧光标记的单细胞悬液为检测样品，通过检测标记荧光的荧光强度来确定所检测细胞或细胞因子的浓度[24]。应用流式细胞技术检测荧光标记的磷酸化蛋白质特异性抗体可以精确测量单细胞内的多参数磷酸化，可以同时在不同的细胞亚群中分析几种信号通路组成元件，大大提高了工作量。研究人员可以根据需要分别检测各细胞亚群的磷酸化水平，从多层次探索信号转导机制，且可以同时分析多种参数之间的相互关系[25]。但流式细胞技术检测需要特异性荧光染料，耗费高、仪器贵。

PhosFlow 是一种可用于研究细胞磷酸化的流式分析技术。Haas 等[26]比较了 PhosFlow 和 Western blot 检测由 CD3 单抗或氧化应激所导致的胞膜近端 TCR 信号分子磷酸化程度及其磷酸化动力学的差异。两种技术皆显示 CD3 单抗或氧化应激诱导的短暂 ZAP70（zeta 链相关蛋白-70）磷酸化都需要酪氨酸激酶的参与。PhosFlow 技术检测提示，与 CD3 单抗诱导的磷酸化相比，氧化应激诱导的磷酸化程度较高。Irish 等[27]应用 PhosFlow 技术研究急性髓系白血病，发现了分别与酪氨酸激酶受体 3 突变、细胞遗传学改变以及与化疗反应相关的特异信号通路特征，并发现不同癌细胞亚群之间也存在不同信号通路。Perl 等[28]采用流式细胞技术对急性髓系白血病患者外周血 PI3K/AKT/mTOR 信号通路进行连续监控，发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）被广泛激活，并发现雷帕霉素在 10 ~ 20 nmol/L 剂量时对 S6 核糖体蛋白磷酸化抑制作用最强，首次提出临床可以通过流式细胞技术评估以 PI3K/AKT/mTOR 为靶标的药物的生物化学效应。Berger 等[29]对纤维素连接蛋白（Fibronectin，FN）改变 Mo-iDCs（单核细胞衍生性未成熟树突状细胞）的形态和功能以及 P38MAPK 和 ERK1/2 信号通路在该过程中的作用进行了研究，通过流式细胞技术发现，经 FN 治疗后细胞基质中 P38MAPK 磷酸化高于治疗前，而治疗前的 ERK1/2 磷酸化强于治疗后。许娜等[30]采用流式细胞技术研究了伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病中结合物蛋白（CRKL）的磷酸化水平，发现经伊马替尼治疗后，患者 p-CRKL 蛋白下降水平与遗传学缓解情况平行，并提出该方法可成为临床监测伊马替尼疗效的常规检测手段。

1.5 质谱分析法

运用质谱可以测定蛋白质的一级结构，包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目及其位置，是一种可发现和鉴别翻译后修饰的方法[31]。基于质谱的蛋白磷酸化分析包括：①识别磷酸化多肽的存在；②根据氨基酸序列确定磷酸化类型；③确定磷酸化位点；④在能够识别磷蛋白质的生物环境下，实时定量确定蛋白磷酸化位点[32]。蛋白磷酸化理论上都可以运用质谱检测，但质谱分析酶解磷酸化蛋白并不能检测全部蛋白序列，可能会有重要磷酸化区域被忽略，且细胞中磷酸化蛋白含量甚微，磷酸化肽段的信号容易被非磷酸化肽段的信号所抑制，所以有必要在质谱分析之前进行磷酸化蛋白和肽段的富集。现已建立的富集磷酸化蛋白、肽的方法有：①双相磷酸多肽谱图；②高分辨率的凝胶电泳；③反相高效液相色谱；④固定金属亲和色谱；⑤高亲和抗体免疫沉淀[33]。

质谱测定蛋白质，依据电离源的不同，可以分为基质辅助激光解析飞行时间质谱和电喷雾电离质谱[32]。质谱仪首先将蛋白多肽离子化，因质荷比不同，多肽在进入分析器时发生分离，通过测量分离肽段离子的相关参数，运用软件实现蛋白鉴定及功能分析[34]。磷酸化蛋白肽段常不稳定，在质谱中会由于自发亚稳态分解或碰撞诱导裂解。利用磷酸酯酶处理后，磷酸化肽段易于丢失 H3PO4或 HPO3，磷酸化丝氨酸或苏氨酸质量数丢失 98 u，而磷酸化酪氨酸由于磷酸基团连接在苯环上只丢失 80 u[35]。质谱利用这些特征可以对磷酸化肽段进行鉴定。

Mayya 和 Han[36]总结了近 5 年有关质谱分析磷酸化的研究，分别从内容、磷酸蛋白组研究的启示、应用广度、现有磷酸化蛋白组研究的局限性 4 个方面进行了论述，并且认为蛋白质磷酸化功能对建立在实验基础上的假设有一定的预测价值。Jaros 等[37]通过固定金属离子亲和层析富集技术和无标记的液相色谱-质谱技术，对临床 80 名志愿者血清中 502 种蛋白内 5825 个磷酸化多肽进行了鉴定，结果表明，血清可能是一个未开发的磷酸化源，可以用于临床疾病变化研究、疾病的病理生理机制探讨以及药物应答标志物的识别。Martins-de-Souza 等[38]对 24 个严重抑郁症患者和 12 个可控制患者死后捐献的脑组织中背外侧前额叶皮层组织提取物进行了分析，采用液相色谱质谱联用技术比较两者磷酸化蛋白的差异，鉴定出 5195 个磷酸化多肽，涉及 802 个非冗余蛋白质，两者结果比较，90% 的磷酸化蛋白有明显表达差异，20% 存在至少 2 个不同磷酸化肽。Jia等[39]建立了利用氧化铈纳米粒子和等压串联质谱标记标签评估蛋白磷酸化绝对化学计量的综合方法，通过直接测量已知磷酸化位点的脱磷酸化水平，经标准肽和胰蛋白酶消化验证该方法准确性和精度之后，成功将该方法用于真核起始因子 3H（eIF3H）的定量磷酸化研究。Ruperez 等[40]揭示了丝氨酸和苏氨酸在人原始 T 细胞早期 TCR 激活中细胞骨架重组作用，通过定量质谱分析法并结合免疫沉淀反应和钛白粉磷酸肽富集等方法共鉴定识别出 2814 种磷酸肽，激发 5 min 后丝氨酸和苏氨酸激酶质谱图像点增多，包含有这些磷酸化位点的蛋白多定位在不同的亚细胞中，大多参与细胞内信号级联反应，主要涉及细胞骨架重组和小 GTP 酶介导的信号转导的调控，也可能涉及免疫突触的形成。

1.6 Bio-Plex 悬液芯片

Bio-Plex 悬液芯片系统是美国伯乐公司开发提供的一个功能强大的芯片技术平台，该技术整合了软件包、系统校检工具、微球体偶联试剂和即用型细胞因子与磷酸化蛋白测试试剂盒，可在单个样品中同时分析多种生物分子，包括酶底物、受体、抗原或者抗体。经过悬液芯片多重检测获得的数据，更有助于从整体揭示生命分子间的相互关系及信号转导途径[41]。同步检测细胞内多重磷酸化蛋白是理解胞内信号转导所必需的，使用悬液芯片技术可以更加高效地检测磷酸化蛋白及其转导途径[42]。但 Bio-Plex 悬液芯片技术对于检测因子间有交叉反应的不能同时检测。

Strehl 等[43]通过 RNA 干扰技术介导糖皮质激素受体降低，研究 HEK 293T 细胞中糖皮质激素膜受体的起源，使用 Bio-Plex 磷蛋白质分析技术和免疫印迹技术分析糖皮质激素膜受体的功能活动，结果表明，HEK 293T 细胞在经过治疗后 P38 MAPK 的磷酸化作用明显增强。Fujioka 等[44]对吗啡阿片受体能激活表皮生长因子受体从而增强生存信号进行了验证，通过 Bio-Plex 芯片技术等免疫组学方法对人肺癌细胞中细胞因子、细胞信号转导以及吗啡阿片受体和表皮生长因子受体共表达区域进行了验证，结果表明，吗啡通过阿片类受体导致下游 MAPK/ERK、AKT 信号通路的磷酸化，可以激活表皮生长因子受体、蛋白激酶 B 的磷酸化。Abadir 等[45]研究了血管紧张素亚型 2 受体和血管紧张素亚型 1 受体的抗炎作用。通过 Western blot 和 Bio-Plex 技术定量检测血管紧张素亚型 2受体的活性、转录蛋白 3 磷酸化程度以及 TNF-α 的含量，结果提示血管紧张素亚型 2 受体的高表达可能通过降低 TNF-α 的生产和 STAT3 信号通路活性从而降低炎症，恢复血管紧张素亚型 2 受体的表达或将其激活，将成为治疗炎症过程的新靶点。Zhang 等[46]针对锌铁调控蛋白 4（ZIP4）调节胰腺癌生长的信号转导通路进行了免疫学验证，通过 Bio-Plex 悬液芯片技术等方法分别对细胞周期蛋白、IL6、和转录激活剂 3 在胰腺癌细胞中的表达进行检测，结果提示高表达 ZIP4 通过 cAMP 反应元件结合蛋白增加 IL-6 转录，IL-6 又激活 STAT3，导致细胞周期蛋白的过量表达，促进胰腺癌细胞增殖和肿瘤增长。

表 1 不同蛋白质磷酸化检测方法优缺点比较

2 小结

上述方法中，质谱法和32P 同位素放射性标记法可以用于检测蛋白质磷酸化位点，确定磷酸化类型；荧光染色和 Western blot 技术主要检测单个蛋白磷酸化，需要配置相应的特异性磷酸蛋白抗体，32P 同位素放射性标记也可以检测单个蛋白，但需要配置放射性检测仪；流式细胞技术可以从细胞层面检测蛋白磷酸化，通过多染料染色可以同时测量单细胞内的多参数磷酸化；Bio-Plex 悬液芯片是高通量因子检测系统，可以从蛋白水平检测多个蛋白磷酸化也可以从细胞层面检测胞内多重蛋白磷酸化而且不局限于单个细胞（表 1）。

鉴定蛋白质复合物样品中相关蛋白磷酸化修饰是蛋白质组学领域中的一个重要部分，虽然已经有多种蛋白质磷酸化分析方法，但现有的磷酸化蛋白质研究手段尚不能完全满足对生物体内多种样品研究的需要，尤其是磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸特异性抗体尚不能完全识别所有残基上连接磷酸基团的蛋白质分子。随着多种生命科学技术的发展，也为了满足蛋白质组学的多样性和复杂性的需要，进行高通量的磷酸化蛋白的相对定量分析研究已成为必然趋势，相信随着蛋白质组学研究的不断深入和发展，磷酸化蛋白质组学分析技术必将得到突飞猛进的发展，为全面和深入地认识生命的复杂活动提供可能。

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国家自然科学基金（81001548、8117334、81173332、81202753）；上海市青年科技启明星计划（12QA1403000）；上海市教育委员会和上海市教育发展基金会“晨光计划”资助项目（10CG45）；上海市卫生局青年基金（2009Y096）；国家中医药管理局中医药重点学科建设项目

杨永清，Email：dryqyang@163.com

2012-12-10

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.010