于相丽，李勇慧，秦 磊

(洛阳师范学院生命科学系，河南洛阳471022)

0 引言

茜草(Rubia Cordifolia L.)为茜草科茜草属植物，别名活血草、锯子草、拉拉草、血见愁等。分布于欧洲、亚洲、美洲和南部非洲［1］。中国有12 种［2］，主产于陕西省、江苏省、安徽省、河南省、山东省。茜草为中国传统常用中药之一，药用其干燥根及根茎，有凉血、止血、祛瘀、通经等功效［3］。

目前，国内对茜草的化学成分和药理作用有广泛的研究，茜草中主要含有水溶性的环已肽类系列物质，脂溶性成分蒽醌及其糖苷、萘醌及其糖苷，此外还含有萜类、β 谷甾醇、脂肪酸化合物和微量元素［4－5］。现代药理研究证明:茜草根水提液在体外对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感杆菌和部分皮肤真菌等均有一定的抑制作用［6］，但是对茜草有机溶剂的提取及根不同部位的抑菌效果没有系统的试验研究。本文采用不同浓度的乙醇作溶剂，研究茜草根不同部位提取液对常见的3 种细菌的抑菌效果，以期为茜草的质量控制和临床使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用茜草于2010 年9 月份采挖于洛阳市孟津县，阴干后将其根分为3 类，即块状的基部根、直径＞8 mm 的粗根以及直径＜8 mm 的细根，分别粉碎并密封保存。

1.2 菌种

供试菌种为大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，由洛阳师范学院生命科学系微生物实验室提供。

1.3 主要仪器设备

QYC-2102 大容量双层全温摇床(上海新苗医疗器械制造有限公司);SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司);101-1AB 型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);DK-98-IIA电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司);LDZX-40KB 不锈钢立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);RE-201C 旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)。

1.4 培养基与试剂

牛肉膏蛋白胨培养基［7］:牛肉膏，蛋白胨，琼脂，NaCl(HCl 或NaOH 调pH 值7.2 ～7.4)。

试剂为无水乙醇，无菌生理盐水等。

1.5 方法

1.5.1 不同体积分数乙醇提取物的制备［8］

取干燥粉碎后的茜草根样品10 g 置于锥形瓶中，加蒸馏水100 mL，55 ℃水浴1 h 后，过滤，残渣加蒸馏水100 mL 于55 ℃水浴1 h，再重复1 次，最后将3 次滤液合并，使用旋转蒸发仪将滤液浓缩至黏着状，用水溶解并定容10 mL，制成1 g/mL 的水悬浊液。以上述方法分别获得体积分数分别为0%、50%、60%、70%、80%的茜草根提取液，依次标记为0%、50%、60%、70%、80%，备用。

1.5.2 菌悬液的制备

将供试菌种置于灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37 ℃、120 r/min 的摇床上培养24 h，经涂片镜检确定为单一菌种后，用无菌生理盐水将菌液稀释成0.5 ×109个/mL 左右。将该菌液置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.5.3 药敏纸片法测定抑菌圈［9］

用打孔器将滤纸打成孔径为5 mm 的圆纸片，高压蒸汽灭菌。分别取3 mL 的0%提取液的基部根、粗根、细根原液于灭菌平皿中，加入等体积的蒸馏水，将灭菌滤纸浸泡30 min 后，置于55 ℃的干燥箱中烘干制成药敏纸片。在超净工作台上将灭菌后的营养琼脂培养基倒入无菌平皿中，每皿约20 mL，取3种供试菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)0.1 mL 均匀涂布到直径为100 mm 的营养琼脂培养基中，用无菌镊子夹取烘干的滤纸片贴在含菌培养基表面，并轻轻按压使充分接触，每皿等距离放4 片，并再放入一个浸生理盐水的纸片作为空白对照，每个试验平行5 次，置于37 ℃的恒温培养箱中培养20 ～24 h 后培养观察并测定抑菌圈直径大小，取平均值。结果为5 次平行试验的平均值，取两位有效数字。同样方法分别进行50%、60%、70%、80%提取液的药敏纸片法测抑菌圈试验操作，计算出抑菌圈的直径并取平均值。将所得的试验结果进行分析比较，从而得出最佳抑菌效果的茜草提取液以进行下面的试验操作。

1.5.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定［9］

在特殊条件下培养24 h，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度。将具有最佳抑菌效果的提取原液(1 g/mL)用无菌水按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64 的体积比进行倍半稀释，得到6 个浓度的稀释提取液，加之原液一共有7 个浓度梯度的提取液，并且分为基部根、粗根、细根3 种。在无菌培养皿中分别加入1.5 mL 不同浓度和不同种类的茜草提取液，然后倒入20 mL 的55 ℃左右灭菌的营养琼脂培养基充分混匀，冷却凝固。分别取0.1 mL 的供试菌悬液，并分别加入到70 mL的无菌生理盐水中混匀，制成浓度106个/mL 左右的菌悬液。取0.1 mL 的稀释菌悬液于平板上涂布均匀，每一系列培养基接种一种菌，每个浓度做3 个重复，以未添加提取液的系列培养基作为空白对照，然后置于37 ℃下培养24 h 后观察。无菌生长的最低浓度即为提取物的MIC。

2 结果与分析

2.1 茜草根不同提取物的抑菌效果比较

表1 为茜草根不同部位的提取液对3 种菌的抑菌圈直径，由表1 可知:水的提取液对3 种供试菌的抑菌效果不明显，而用不同体积分数的乙醇提取的茜草液(浓度为0.5 g/mL)抑菌效果较好。由表1 还可以看出:60%乙醇提取液对3 种菌均有相对较好的抑菌效果;从60%乙醇提取液的抑菌活性向两侧整体呈减小趋势。为了验证这一结论，又多次重复50%和70%乙醇提取液的抑菌实验，结果没有显著差异。60%乙醇茜草基部根提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为7.80 mm、8.78 mm、7.88 mm。60%乙醇茜草粗根提取液对3 种菌的抑菌圈直径分别为7.65 mm、8.63 mm、7.58mm。60%乙醇茜草细根提取液对3 种菌的抑菌圈直径分别为7. 08 mm、7. 80 mm、8.58mm。由50%、70%、80%乙醇提取液抑菌效果及上述结果表明:茜草根不同部位提取液总体上对金黄色葡萄球和枯草芽孢杆菌的抑菌效果要比大肠杆菌的效果好，特别是60%细根提取液对枯草芽孢杆菌抑菌效果要比基部根和粗根明显。

表1 茜草根不同部位的提取液对3 种菌的抑菌圈直径

表2 为不同提取液抑菌效果差异显著性分析。由表2 可知:60%提取液与50%、70%、80%及水提取液均有极显著差异，60%乙醇提取液抑菌效果最好，所以在MIC 的确定中，使用60%乙醇提取液。

表2 不同提取液抑菌效果差异显著性分析

对于不同菌种的抑菌活性差异见表3。由表3 看出:茜草根提取液对大肠杆菌抑菌效果较差，而对于枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌来说，其效果有显著差异。

表3 不同菌种抑菌活性的差异显著性

2.2 茜草根不同提取物对3 种供试菌的MIC 的测定和比较

表4 为不同茜草根60%乙醇提取液MIC。由表4 可知:对照组有大量的菌生长，说明待测物的抗菌活性来自于其本身。茜草基部根提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为0.250 g/mL、0.125 g/mL、0.125 g/mL;茜草粗根提取液对3 种供试菌的最低抑菌浓度分别为0.250 g/mL、0.125 g/mL、0.125 g/mL;茜草细根提取液对3 种菌的最低抑菌浓度分别为0.500 g/mL、0.250 g/mL、0.125 g/mL。说明茜草的基部根、粗根、细根提取液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果优于大肠杆菌。

表4 不同茜草根60%乙醇提取液MIC g/mL

3 讨论

茜草根不同部位的抑菌活性有显著差异，以基部根效果最好，说明其药效也是最好的，基部根正处于根和茎连接处，抑菌物质合成与运输都要通过此处，故其有效成分含量较高，抑菌效果最好。而细根由于处于快速生长期，其抑菌物质的积累较少，故抑菌效果较差。

茜草抑菌物质的提取时间和提取温度也会影响试验结果，在提取过程中抑菌物质会有一定的损失，在一定程度上也会影响试验结果。不同地域的茜草根含有的抑菌物质的含量也不尽相同，需要进一步地对本地产茜草的抑菌物质进行分析，以得出抑菌物质的成分，将有利于人们利用茜草，发挥其作用。

［1］ 侯宽昭.中国种子植物科属词典［M］.北京:科学出版社，1982:422.

［2］ 罗献瑞.中国茜草科资料(五)［J］.热带亚热带植物学报，1999，7(1):l5.

［3］ 药典编委会.中华人民共和国药典:第一部［M］.北京:人民卫生出版社，2005.

［4］ 方晓艳，孙艳红，杨林莎.茜草的研究进展［J］.河南中医药学刊，2002，17(5):78－80.

［5］ 张振英，黄显峰.茜草的药理作用研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2007，17(5):58－60.

［6］ 宋立人，洪恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典［M］.北京:人民卫生出版社，2001:1463－1466.

［7］ 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验［M］.3 版.北京:高等教育出版社，1999:214－215.

［8］ 谭朝阳，尤昭玲.茜草提取工艺的研究［J］.中草药，2004，35(4):399－401.

［9］ 周莲杰，贺转转，古丽斯玛依·艾拜都拉，等.新疆部分特色林果果壳的抗菌活性研究［J］.生物技术通讯，2010，21(6):855－856，860.