詹晓北 郑志永 古立谦 朱 莉 吴剑荣 张洪涛

(1.江南大学生物工程学院 /糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;2.日照职业技术学院食品工程学院,山东日照 276826;3.江苏瑞光生物科技有限公司,江苏无锡 214125)

微生物多糖是近年来利用现代工业生物技术开发的新型产品，在食品、石油、医药等工业中具有广阔应用前景.虽然我国已成为黄原胶的第一大生产国，但高品质和高性能微生物多糖的生产仍与国外先进技术存在较大差距:1)常规反应器的传质和混合效率不能满足高黏度发酵的需要，气体分散效果不理想，生产过程的能耗占成本的比重较大[1];2)生产工艺以常规的分批发酵为主，产胶期的营养和能量供给结构没有与微生物的实际需求很好地匹配[2-3];3)微生物对氧的利用效率还有提高的空间，不能物尽所用[4].因此需要从微生物菌种的代谢工程、发酵工艺和生物反应器等方面克服高黏度发酵过程中存在的关键问题.

1 微生物多糖合成过程中的能量代谢途径

随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展，微生物多糖合成的遗传背景和代谢途径的研究正逐步深入.研究人员发现[5-6]，微生物多糖在合成过程中存在着大量的能量耗散现象，即多糖合成过程中的能量效率远低于细胞生长过程的能量效率，影响着微生物细胞对氧气的有效利用.因此，若要提高目标产物的转化率和产率，就需要从产能途径进行代谢工程改造，以提高能量的产生效率或降低能量代谢过程中的耗散.好氧细菌的能量代谢包括底物水平磷酸化和氧化磷酸化两个方面，而后者是能量产生的主要方面.迄今为止，对微生物多糖生产菌实施的代谢工程研究多着重于:1)解除多糖合成途径的代谢调节[7];2)过量表达多糖合成途径关键酶的水平[8].除此之外，通过改善细胞膜的电子传递效率或产能效率来提高目标产物生产率和转化率也是另一可能的途径.从糖酵解的代谢调控机理可知，微生物多糖合成的主要节点6-磷酸葡萄糖激酶的活性受到细胞内能荷的调控，当磷酸烯醇式丙酮酸或ATP处于过量时，6-磷酸葡萄糖激酶的活性将受到抑制，此外，磷酸戊糖途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶受还原力NADH的抑制.这说明，当细胞内的能荷处于高位时，一方面糖酵解和磷酸戊糖循环将受到抑制[9]，代谢流将向微生物多糖合成的方向流动.这表明保持细胞内的高能荷状态有利于微生物多糖的合成.

热凝胶产生菌土壤杆菌ATCC 31749在细胞生长阶段和产物合成阶段的能量消耗差异显著，根据文献[10]报道的电子传递链蛋白的保守序列，设计简并引物并通过qTR-PCR克隆土壤杆菌属中DNA部分序列[11]，通过基因比对分析法确定了包括氧化还原NADH辅酶Q、琥珀酸复合脱氢酶II、辅酶Q合成蛋白质UbiB、细胞色素d末端氧化酶、细胞色素bo末端氧化酶、细胞色素cbb3-型末端氧化酶、细胞色素caa3-型末端氧化酶、苹果酸脱氢酶8种电子传递链成分如图1，比较分析了土壤杆菌ATCC 31749中8种电子传递链成分的基因，通过与根癌土壤杆菌C58、葡萄土壤杆菌S4及放射状土壤杆菌K84相似度比较，发现土壤杆菌ATCC 31749与根癌土壤杆菌C58的相似度最高.根据基因相似性及参考根癌土壤杆菌C58的电子传递链结构，提出了土壤杆菌ATCC 31749的电子传递链的基本框架图，如图1所示，发现该菌存在4个末端氧化酶，其中对氧低亲和性的Cyto-bo和Cyto-caa3末端氧化酶在高溶氧条件下激活，而对氧高亲和性的Cyto-d和Cyto-cbb3末端氧化酶在微氧环境下激活，表明该菌能根据不同的溶氧水平调控呼吸链途径和能量产生效率.

图1 土壤杆菌ATCC 31749的电子呼吸链途径Fig.1 Electron respiratory chain pathways in Agrobacterium sp.ATCC 31749

大肠杆菌不具有细胞色素c、细胞色素bc1复合体和复合体IV(细胞色素c末端氧化酶)，而只有细胞色素bo和细胞色素d复合体[12]，这与土壤杆菌ATCC 31749并不相同.在呼吸链中，细胞色素cbb3-型及细胞色素caa3-型末端氧化酶复合体的有效能量效率比细胞色素d复合体和细胞色素bo复合体要高.因此，在土壤杆菌ATCC 31749中存在细胞色素cbb3-型及细胞色素caa3-型末端氧化酶复合体可能是其具有高效UDP-葡萄糖再生系统的原因之一.在热凝胶合成过程中，pH环境对土壤杆菌ATCC 31749合成热凝胶是至关重要的，热凝胶合成依赖于ATP能量支撑[6]，但是ATP的再生依赖于细胞膜上H+梯度.其高效ATP再生系统的另一原因可能是:环境的酸胁迫产生的细胞膜内外H+梯度对ATP再生起到促进作用.进一步通过qRT-PCR研究了溶氧对热凝胶合成相关途径中异柠檬酸脱氢酶、葡萄糖磷酸变位酶和UDPG尿嘧啶转移酶等10个有代表性的酶基因转录丰度的影响，考察了溶氧与热凝胶合成及其代谢途径中酶基因转录的影响关系[13].

2 微生物多糖的营养需求与高效生产工艺

目前，在微生物多糖生产工艺方面的研究往往集中于微生物的培养环境优化、补料工艺以及pH和溶氧控制方面[14-15]，对于微生物多糖等次级代谢产物而言，提高细胞生物量是高强度合成产物的基础.微生物生长和多糖的合成都是高耗氧的过程，由于高黏度多糖的分泌既阻碍了细胞的生长，也限制了微生物多糖合成的产量和生产强度，多糖的产量一般在25～40 g/L，生产强度一般在0.25～0.50 g/(L·h).随着现代智能控制技术的发展，高密度培养技术在大肠杆菌和毕赤酵母等微生物中得到广泛应用[16].虽然高密度培养技术在高黏度发酵过程中直接应用是不太现实的，但由于大部分微生物多糖均属于次级代谢产物，若将微生物细胞培养与多糖合成分为两个步骤进行，第一步在种子罐(预备罐)中以低C/N营养条件快速高密度培养微生物，第二步在发酵罐中稀释细胞后以高C/N营养条件高强度生产微生物多糖.那么利用该工艺，一方面可减少大型发酵罐的占用时间、节省大型发酵罐在培养细胞过程的功率消耗和能量消耗，另一方面可提高细胞培养和多糖合成的生产强度，使生产过程达到工艺紧凑、节能降耗的要求.

热凝胶的分批发酵过程可分为两个步骤，即细菌生长期(第一步)和热凝胶合成期(第二步).在菌体生长过程中，如图2，初始葡萄糖质量浓度为15 g/L，当葡萄糖质量浓度低于2 g/L时，利用恒速流加葡萄糖的方法来实现土壤杆菌的高密度培养，经过22.5 h后，生物量达到29 g/L.热凝胶的合成速率取决于生物量，在菌体生长阶段结束后，高浓度菌体被引入第二步操作的发酵罐中，由于第二步操作的发酵罐中不存在氮源，菌体将迅速进入产胶阶段和热凝胶生产.如图3，通过改变第二步操作的发酵罐中培养基体积，从第一步培养获得的菌体在第二步操作的发酵罐中被培养基稀释至细胞质量浓度分别是6，11，21.5 g/L，从而直接使微生物培养进入产胶期.从图3可以看出热凝胶的产量随着时间而逐渐增加，但在菌体质量浓度为11 g/L时，热凝胶的产量达到最大，为67 g/L，热凝胶的生产强度也达到最大，为 1.03 g/(L·h).

图2 低C/N营养条件下土壤杆菌ATCC 31749的高密度培养过程Fig.2 High-density cultivation by Agrobacterium sp.ATCC 31749 under low C/N nutritional condition

图3 高C/N营养条件下不同生物量对热凝胶合成强度的影响Fig.3 Effect of various biomass concentrations on curdlan productivity under high C/N nutritional condition

3 针对高黏度发酵体系的生物反应器

在新型搅拌桨设计方面，设计了新型的锯齿形对称折叶涡轮搅拌桨(见图4)，并已申请中国专利[17]，搅拌桨属径流剪切桨，由于圆盘上下的斜叶片之间呈一定角度的夹角，适合大气量在液体中的分散，提高了液体的流动性.由于上下两叶片的内缘形成一夹缝，并且夹缝的开度随搅拌桨半径增加而增加，可供一部分流体通过，避免了在叶片背面形成气穴，同时减少了搅拌功率的消耗.在搅拌桨的斜叶片内缘和外缘设有锯齿，增加了边界的接触面，提高了流体剪切力，提高了气-液分散能力和对高黏度假塑性流体的剪切稀释作用，为高黏度的好氧发酵体系提供了有效的气-液传质保证，节省了高黏度流体搅拌过程的功率消耗，利用搅拌桨吐出场的压力变化及低动力叶轮的扬力使流体集中，产生了强大的剪断破坏作用.通过小规模的生物反应器实验中，冷模实验结果表明该桨具有高效的气液分散和传质能力.

图4 锯齿形对称折叶涡轮搅拌桨Fig.4 Pitched blade with symmetrical sawtooth turbine impeller

图5是采用CFD方法模拟了6种搅拌系统中非牛顿流体运动的速度矢量图[18-19]，平板直叶搅拌桨和锯齿形对称折叶搅拌桨为径向流搅拌桨，形成双循环流型.液体被搅拌桨从轴方向吸入而向与轴近似垂直的方向排出.在槽内形成上下两个表观上被搅拌桨圆盘分隔的循环流动.螺旋圆锥曲面搅拌桨为轴向流搅拌桨，液体在搅拌槽内形成了一个上下流动的大循环.液体在桨叶区向外侧下方排出.大部分液体在壁面附近转向上运动，然后循环回到桨叶区.图5a中平板直叶搅拌桨和锯齿形对称折叶搅拌桨的径向流特征比较明显，图5b、图5c中由于螺旋圆锥曲面搅拌桨的加入两径向流桨的径向流特征有所减弱.图6采用CFD方法模拟了6种搅拌系统中非牛顿流体运动的kLa分布图，虽然SKK搅拌系统所提供的kLa不是最高，但是其所需的搅拌功耗最低，因此其氧传质效率最高，比传统的DDD提高23%，因此这种组合搅拌系统在高黏度发酵中有较好的应用前景.

图5 组合搅拌系统速度矢量图Fig.5 Velocity vector of combined flow impeller

图6 组合搅拌系统的kLa分布图Fig.6 kLa distribution of combined flow impeller

在针对高黏度发酵液的反应器系统设计研究方面，1)采用了计算流体力学的最新研究成果，整合了自主研发的锯齿形对称折叶涡轮搅拌桨和轴向分散混合性能优良的螺旋圆锥曲面搅拌桨，采用多档不同型式的搅拌桨组合系统，自下而上第二档以上采用高效轴向流搅拌桨，促进非牛顿流体做上下混合快速流动;2)针对非牛顿型流体在反应器中不易产生涡流的特点，在反应器上半部分减少档板高度，以节省搅拌混合过程的能量损耗;3)为了同时满足发酵过程的高气液分散和高效混合，引入气升式反应器的优势特征，采用大高径比的罐体，延长汽泡在罐内的停留时间和促进气液传质交换.试制的生物反应器分别在小试规模(500 L)、中试规模(5 m3)和生产规模(50 m3)下进行了试验，取得了预期的效果，结果表明，采用的新型搅拌系统比标准发酵罐节省电耗约30%，同时体积传质系数提高20%～30%.通过微生物多糖结冷胶的工业实践，使结冷胶发酵水平提高20%左右，50 m3生物反应器装置现已在合作工厂使用一年，效果显著.

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